Submillisecond конформационные изменения в белках решены фототермического отклонения луча
Summary
Здесь мы сообщаем применение методики отклонения фототермическая луча в сочетании с в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, для отслеживания микросекундные и миллисекундные динамику и энергетику структурных изменений, связанных с ассоциацией кальция в нейронной датчика кальция, Переработка регуляторный элемент антагонистов модулятор .
Abstract
Отклонение Фототермическая луч вместе с фото-акустической калориметрии и термического решетки принадлежит к семейству фототермических методов, которые контролируют Время-профиля громкости и энтальпии изменения света, индуцированные конформационные изменения в белках на микросекунды до миллисекунды временные рамки, которые не доступны в режиме обычного стоп -потока инструменты. Кроме того, поскольку общий изменения объема и / или энтальпии зондируются, эти методы могут быть применены к белков и других биомакромолекул, которые не имеют флуорофор и этикетку или хромофора. Для мониторинга динамики и энергетику структурных изменений, связанных с Са 2 + привязка к кальция преобразователей, таких нейронных датчиков кальция, в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, используется для фото-триггера быстрой (τ <20 мкс) увеличение свободного кальция концентрации и связанное с ним объема и энтальпии зондируются используя технику отклонения фототермическая луча.
Introduction
Фототермические методы, такие как фотоакустического калориметрии, прогиб фототермическая пучка (PDB), и переходных решетки в сочетании с наносекундного лазерного возбуждения представляют собой мощную альтернативу переходных оптических спектроскопии для временным разрешением исследований короткоживущих промежуточных 1,2. В отличие от оптических методов, таких как нестационарного поглощения и ИК-спектроскопии, что наблюдение за временной профиль изменения поглощения в окружающем хромофора; фототермические методы обнаружить временную зависимость изменений тепло / объем и, следовательно, являются ценными инструментами для исследования временных профилей оптически "молчаливые" процессы. До сих пор, фотоакустическая калориметрии и переходные решетки успешно применяется для изучения конформационных динамику фотоиндуцированных процессов, включая двухатомной миграции лиганда в глобинов 3,4, лиганд взаимодействия с белком кислородного датчика FixL 5, электрон и протон транспорт в гема-медь оксидазы 6й фотосистемы II, а также фото-изомеризации в родопсина 7 и конформационной динамики криптохрома 8.
Чтобы расширить применение методов фототермических в биологических системах, которых не хватает внутреннего хромофора и / или флуорофор, техника PBD сочеталась с использованием клетке соединения к фото-триггера увеличение концентрации лиганд / подложки в течение нескольких микросекунд или быстрее, в зависимости на клетке соединения. Такой подход позволяет мониторинг динамики и энергетики структурных изменений, связанных с лиганд / связывание субстрата с белками, которых не хватает внутреннего флуорофор или хромофора и на временной шкале, которые не доступны инструментов коммерческих стоп-потока. Здесь применение PBD контролировать термодинамику клетке соединения, Ca 2 + DM-nitrophen, фото-расщепление, а также кинетика для Ca 2 + ассоциации с С-концевого домена нейронной датчика кальция внизпоток регуляторный элемент антагониста модулятор (DREAM) представлена. Са 2 + является фото-освобожден от Ca 2 + DM-nitrophen в пределах 10 мкс и повторную привязку к unphotolysed клетку с постоянной времени ~ 300 мкс. С другой стороны, в присутствии apoDREAM дополнительной кинетической происходит на временной шкале миллисекунд наблюдается и отражает связывание лиганда с белком. Применение PBD, чтобы исследовать конформационные переходы в биологических системах была как-то ограничена из-за инструментальных трудностей; например трудным выравнивание зондом и пучка накачки для достижения сильного и воспроизводимый сигнал PBD. Однако тщательная разработка контрольно-измерительного настройке, точный контроль температуры и осторожны выравнивание пробного луча и насоса обеспечивают последовательный и надежный сигнал PBD, который позволяет мониторинг временным разрешением объема и изменения энтальпии на широкий временная шкала от 10 мкс до примерно 200 мс. Кроме того, Modificобъема экспериментальной процедуры, чтобы гарантировать обнаружение проб и эталонных трасс под одинаковой температурой, буферной состава, ориентации оптических клеток, мощности лазера и т.д. значительно снижает экспериментальную ошибку в измеренных реакционных объемов и энтальпий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Физический принцип фототермических методов является то, что фото-возбужденная молекула рассеивает избыточную энергию через колебательной релаксации в основное состояние, в результате чего теплового нагрева окружающего 1,12 растворителя. Для растворителей, таких как вода, это пр…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (MCB 1021831, JM) и Дж. & программы биомедицинских исследований Е. (Флорида Департамента здравоохранения, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochimie. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
