Millisecondo conformazionali Variazioni proteine risolti dal Photothermal Rinvio del raggio
Summary
Qui riportiamo un'applicazione della tecnica deflessione del fascio photothermal in combinazione con un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, per monitorare microsecondi e millisecondi dinamica ed energetica di cambiamenti strutturali connessi con l'associazione calcio per un sensore calcio neuronale, Downstream elemento di regolazione Antagonista Modulator .
Abstract
Deflessione del fascio Photothermal insieme con la foto-acustica calorimetria e griglia termica appartiene alla famiglia dei metodi fototermiche che controllano il volume e il tempo di entalpia profilo cambiamenti di luce indotti cambiamenti conformazionali nelle proteine sulla microsecondo per millisecondo scale temporali che non sono accessibili con fermata tradizionale -flow strumenti. Inoltre, poiché le variazioni complessiva del volume e / o entalpia vengono sondati, queste tecniche possono essere applicate a proteine e altre biomacromolecole che mancano di un fluoroforo e o un'etichetta cromoforo. Per monitorare la dinamica ed energetica dei cambiamenti strutturali connessi con Ca 2 + vincolante ai trasduttori di calcio, tali sensori di calcio neuronali, un composto di calcio in gabbia, DM-nitrophen, è impiegato per foto-trigger un facile (τ <20 msec) aumento del calcio libero variazioni di concentrazione e il volume associato e entalpia vengono sondati con fascio fototermica tecnica di deflessione.
Introduction
Photo-thermal metodi come la calorimetria fotoacustica, deflessione del fascio fototermica (PDB), e griglia transitoria accoppiato con eccitazione laser nanosecondo rappresentano una potente alternativa a transitori spettroscopie ottiche per gli studi risolta in tempo di breve durata intermedi 1,2. Contrariamente alle tecniche ottiche, come l'assorbimento transiente e spettroscopia IR, che monitorano il profilo temporale delle variazioni di assorbimento nella cromoforo circostante; tecniche fototermiche rilevano la dipendenza dal tempo delle variazioni di calore / volume e quindi sono strumenti preziosi per lo studio di profili temporali otticamente processi "silenti". Finora, calorimetria fotoacustica e griglia transitorio è stato applicato con successo per studiare la dinamica conformazionale dei processi foto-indotto compreso diatomic migrazione ligando in globine 3,4, interazioni ligando con proteine sensore di ossigeno FixL 5, elettrone e trasporto di protoni in eme-rame ossidasi 6 unnd fotosistema II così come foto-isomerizzazione in rodopsina 7 e dinamica conformazionale in cryptochrome 8.
Per espandere l'applicazione di tecniche fototermiche a sistemi biologici che mancano un cromoforo interno e / o fluoroforo, la tecnica PBD è stato combinato con l'uso di composti gabbia a foto-trigger un aumento della concentrazione di ligando / substrato giro di pochi microsecondi o superiore, a seconda sul composto gabbia. Questo approccio consente il monitoraggio delle dinamiche e l'energetica dei cambiamenti strutturali connessi con il ligando / substrato legame alle proteine che mancano di un fluoroforo interno o cromofori e scala temporale che non sono accessibili con strumenti stop-flow commerciali. Qui un'applicazione di PBD per monitorare la termodinamica del composto gabbia, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-scissione e la cinetica di Ca 2 + associazione al dominio C-terminale del sensore calcio neuronale Giùflusso di regolamentazione Elemento Antagonista modulatore (Dream) è presentato. Il Ca 2 + è foto-rilasciato da Ca 2 + DM-nitrophen entro 10 msec e riassocia a una gabbia unphotolysed con una costante di tempo di ~ 300 msec. D'altra parte, in presenza di apoDREAM si osserva una cinetica supplementare che si verificano sul millisecondo scala temporale e riflette il legame alla proteina ligando. L'applicazione del PBD per sondare transizioni conformazionali nei sistemi biologici è stata in qualche modo limitato a causa delle difficoltà strumentali; allineamento es arduo della sonda e fascio di pompa per ottenere un segnale forte e riproducibile PBD. Tuttavia, una progettazione meticolosa di una strumentazione set-up, un controllo preciso della temperatura, e un attento allineamento del fascio sonda e pompa forniscono un segnale coerente e robusto PBD che consente il monitoraggio di volume-tempo risolto e variazioni di entalpia su un ampio scala temporale da 10 msec a circa 200 msec. Inoltre, modificzioni della procedura sperimentale per assicurare la rilevazione di campione e di riferimento tracce sotto temperatura identica composizione del tampone, orientamento cella ottica, potenza del laser, ecc riduce significativamente l'errore sperimentale in volumi di reazione misurati ed entalpie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il principio fisico dietro metodi fototermiche è che una molecola fotoeccitati dissipa l'energia in eccesso tramite vibrazionale rilassamento allo stato fondamentale, con conseguente riscaldamento termico del 1,12 solvente circostante. Per solventi come acqua, questo produce una rapida espansione del volume (ΔV th). Molecole Eccitato statali possono anche subire processi fotochimici che si traducono in variazioni di volume non termici (ΔV nonth) a causa di legame scissione / forma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) e J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
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