光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化
Summary
ここでは、下流の調節エレメント拮抗モジュレータ、マイクロ秒およびミリ秒ダイナミクスおよびニューロンカルシウムセンサーへのカルシウムアソシエーションに関連付けられている構造変化のエネルギー論をモニターするために、DM-nitrophen、ケージドカルシウム化合物と組み合わせて光熱ビーム偏向技術の適用を報告。
Abstract
一緒に光音響熱量測定および熱格子と光熱ビーム偏向は、伝統的なストップを使用してアクセスできない時間スケールをミリ秒、マイクロ秒でのタンパク質の立体構造変化を誘起光の時間プロファイルボリュームとエンタルピー変化を監視する光熱方法のファミリーに属するフローの楽器。さらに、体積および/またはエンタルピーの全体的な変化がプローブされているので、これらの技術は、タンパク質およびフルオロフォアおよび発色団又はラベルを欠く他の生体高分子に適用することができる。カルシウムトランスデューサ、このような神経細胞のカルシウムセンサー、ケージカルシウム化合物、DM-nitrophenへの結合のCa 2 +に関連した構造変化のダイナミクスとエネルギー論を監視するには、フォトトリガーに遊離カルシウムの急速な（τ<20秒）増加して採用されている濃度及び関連するボリュームとエンタルピー変化は、光熱ビーム偏向技術を用いてプローブする。
Introduction
このような光音響熱量測定、光熱ビーム偏向（PDB）、およびナノ秒レーザー励起で結合された過渡回折格子などの光熱方法は、短寿命中間体1,2の時間分解研究のための過渡光分光法への強力な代替物である。そのような過渡吸収及びIR分光法などの光学技術とは対照的に、それは周囲の発色団の吸収変化の時間プロファイルを監視、光熱技術は、熱/体積変化の時間依存性を検出し、したがって、光学の時間プロファイルを調べるための貴重なツールである「サイレント」のプロセス。これまでのところ、光音響熱量測定および過渡回折格子が正常グロビン3,4、酸素センサータンパク質とリガンドの相互作用における二原子リガンドの移行を含む光誘起プロセスのコンホメーションのダイナミクスを研究するために適用されているFixL 5、6オキシダーゼ電子とヘム-銅におけるプロトン輸送AND光化学系IIだけでなく、ロドプシン7とクリプトクロム8の立体構造力学の光異性化。
内部発色団および/またはフルオロフォアを欠いている生物学的システムへの光熱技術の適用を拡大するため、PBD技術は依存して、光トリガにケージド化合物を用い、数マイクロ秒以内に、リガンド/基質濃度の増加またはより速いと組み合わせたケージド化合物に関する。このアプローチは、ダイナミクスと内部フルオロフォアまたは発色団を欠いていると商業ストップフロー機器からはアクセスできませんタイムスケール上にあるタンパク質に結合するリガンド/基質に関連する構造変化のエネルギー論のモニタリングを可能にする。ここではダウンニューロンのカルシウムセンサーのC末端ドメインにケージ化合物の熱力学を監視するためのPBDのアプリケーション、Ca 2 +のDM-nitrophen、光切断だけでなく、Ca 2 +の関連についての動態ストリーム調節エレメント拮抗モジュレータ（DREAM）が提示されている。 Ca 2 +を、光にリリース〜300秒の時定数でunphotolysedケージにCa 2 +を 10秒と再バインド内のDM-nitrophenからのものである。一方、apoDREAMの存在下で、ミリ秒の時間スケールで発生する追加の運動を観察し、タンパク質へのリガンド結合を反映している。生物系の高次構造遷移をプローブするPBDの適用は、何らかの形で楽器の難しさのために制限されている、強力かつ再現性のPBD信号を達成するためのプローブとポンプ光の例えば骨の折れる整列。しかし、計測機器のセットアップの綿密な設計、温度の正確な制御、およびプローブとポンプ光の慎重な位置合わせは、広範な上、時間分解体積とエンタルピー変化のモニタリングを可能にする一貫性と堅牢PBD信号を提供10秒で約200ミリ秒の時間スケール。また、modificなど 、同一温度、緩衝液組成、光学セルの向き、レーザパワー、下のサンプルとリファレンストレースの検出を確実にする実験手順の管理ポイントを大幅に測定された反応容量およびエンタルピーでの実験誤差を低減します。
Protocol
Representative Results
Discussion
光熱方法の背後にある物理的な原理は、光励起分子は周囲の溶剤1,12の熱加熱で、その結果、基底状態に振動緩和を経由して余分なエネルギーを消費するということです。水などの溶媒の場合、これは急激な体積膨張（ΔVth）を生成する。励起状態の分子はまた、結合開裂/形成および/ または分子の（ファンデ、すなわち変化の分子の大きさを変えることができる分…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、全米科学財団（MCB 1021831、JM）とJ.＆E.生物医学研究プログラム（保健フロリダ部、JM）によってサポートされていました。
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
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