Fototermal Işın Sapmasına tarafından Çözülmüş Proteinler Submillisecond Konformasyonel değişiklikler
Summary
Burada mikrosaniye ve milisaniyelik dinamikleri ve nöronal kalsiyum sensör, aşağı akış düzenleyici öğe Antagonist modülatörüne kalsiyum bağlanma kapasitesi ile bağlandığı yapısal değişikliklerin enerjileri izlemek için bir kafesli kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen ile kombinasyon halinde fototermal ışın saptırma tekniğin bir uygulama rapor .
Abstract
Birlikte fotoğraf-akustik kalorimetrisinden ve termal mazgal Fototermal ışın saptırma geleneksel Dur kullanarak erişilebilir değil zaman ölçekler milisaniye mikrosaniye proteinlerin yapısal değişimlere neden ışığın zaman profil hacim ve entalpi değişimleri izlemek fototermal yöntemleri ailesine ait -akış aletleri. Hacim ve / veya genel entalpi değişiklikleri sondalandı Ek olarak, bu teknikler, bir florofor ve bir kromofor veya etiket protein eksikliği ve diğer biomacromolecules uygulanabilir. Ca 2 ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjikliğin izlemek için + kalsiyum dönüştürücüler gibi nöronal kalsiyum sensörler, kafesli bir kalsiyum bileşiği, DM-nitrophen, fotoğraf-tetik serbest kalsiyum hızlı bir (τ <20 mikro-saniye) artışı istihdam edilmektedir bağlanma konsantrasyon ve bununla bağlantılı ve entalpi değişiklikleri fototermal ışın saptırma tekniği kullanılarak sondalandı.
Introduction
Böyle foto akustik kalorimetrisine, fototermal ışın saptırma (PDB) ve nanosaniye lazer uyarma ile birlikte geçici mazgal gibi foto-termal yöntemler kısa ömürlü ara 1,2 zaman çözüme çalışmaları için optik spectroscopiesle geçici güçlü bir alternatif temsil eder. Bu tür geçici emme ve IR spektroskopisi gibi optik teknikler, aksine, bu çevreleyen kromofor soğurma değişimlerin zaman profilini izlemek, fototermal teknikleri optik zaman profilleri araştırılması için değerli araçlar ısı / hacim değişikliklerini gösteren bir zaman-bağımlılığı tespit etmek ve bu nedenle "sessiz" süreçleri. Şimdiye kadar, foto akustik kalorimetri ve geçici ızgara başarılı globinlerine 3,4, oksijen sensörü protein ile ligand etkileşimlerine atomlu ligand göçü de dahil olmak üzere foto-neden olduğu işlemlerin yapısal dinamiklerini incelemek için uygulanmış FixL 5, 6 oksidazlar elektron ve hem-bakır proton nakliye Birnd fotosistem II olarak rodopsin 7 ve 8 kriptokrom konformasyonel dinamiğinde verilmedi-izomerizasyon.
Bir iç kromofor ve / veya flüorofor eksik biyolojik sistemlere fototermal tekniklerinin kullanılmasını genişletmek için, PBD teknik olarak, foto-tetikleyiciye kafesli bileşiğinin kullanılması birkaç mikrosaniye olan ligand / alt-tabaka konsantrasyonunda bir artış ile ya da daha hızlı birleştirildi kafesli bileşik üzerinde. Bu yaklaşım sağlar ligand / substrat bir iç flüoroforu veya kromofora eksik olan proteinler ve ticari stop akış araçlar tarafından erişilebilir olmayan zaman-ölçeğinde bağlama ile ilişkili yapısal değişikliklerin dinamikleri ve enerjilerin izlenmesi. Burada kafes bileşiğin, Ca 2 + termodinamik DM-nitrophen, foto-yarılma hem de nöronal kalsiyum sensörünün C-terminal alanına Ca2 + Birliği için kinetik aşağı izlemek için PBD bir uygulamadere Düzenleyici Eleman rakip Modülatör (DÜŞ) sunulmuştur. Ca 2 + 10 mikro-saniye içinde foto-serbest Ca 2 + DM-nitrophen ve ~ 300 mikro saniye bir zaman sabiti ile bir unphotolysed kafesine rebinds. Diğer taraftan, apoDREAM mevcudiyetinde milisaniye ölçekte oluşan ek bir kinetik gözlenen ve proteine bağlanma ligandı yansıtmaktadır. Biyolojik sistemlerde konformasyonel geçişler araştırmak üzere PBD uygulama bir şekilde etkili zorluklar nedeniyle sınırlıdır; güçlü ve yeniden üretilebilir bir PBD sinyal elde etmek için prob ve pompa ışınının, örneğin zorlu bir hizalama. Ancak, alet set-up titiz bir tasarım, sıcaklığın bir hassas kontrolü, ve prob ve pompa ışın dikkatli bir hizalama geniş bir zaman içinde çözünen hacmi ve entalpi değişiklikleri izlenmesine olanak sağlar tutarlı ve sağlam PBD sinyalini sağlamak 10 mikro saniye olduğu yaklaşık 200 msn den zaman ölçeği. Buna ek olarak, modific Invb aynı sıcaklık, tampon bileşimi, optik hücre yönelim, lazer gücü altında örnek ve referans izleri tespit sağlamak için deneysel işlemin ations anlamlı ölçülen reaksiyon hacimleri ve entalpilerinin yılında deneysel hatayı azaltır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fototermal yöntemleri geride fiziksel prensibi bir fotoğraf heyecanlı molekülü çevreleyen çözücü 1,12 termal ısıtma sonuçlanan, zemin durumuna titreşim rahatlama yoluyla fazla enerjiyi dağıtacağını olmasıdır. Örneğin su gibi çözücü maddeler, bu hızlı bir hacim genişlemesi (ΔV th) üretir. Uyarılmış hal moleküller de bağlı bağı kırma / formasyonu ve / veya molekül (ler) i (van der yani değişiklikler moleküler boyutları değiştirebilir molekül y…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1021831, JM) ve J. & E. Biyomedikal Araştırma Programı (Sağlık Florida Bölümü, JM) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochimie. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
