Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة
Summary
نحن هنا الإبلاغ عن تطبيق تقنية انحراف شعاع حراري ضوئي؛ بالاشتراك مع مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، لرصد ميكروثانية وميلي ثانية واحدة ديناميكية و طاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة ارتباط الكالسيوم إلى الخلايا العصبية جهاز استشعار الكالسيوم، العنصر التنظيمي المصب خصم المغير .
Abstract
ضوحراري شعاع انحراف معا مع الصورة الصوتية الكالوري وصريف الحرارية ينتمي إلى عائلة من أساليب حراري ضوئي؛ التي ترصد حجم والمحتوى الحراري تغييرات التوقيت الشخصى الضوء الناجم عن التغيرات متعلق بتكوين جزئي في البروتينات على ميكروثانية إلى ميلي ثانية واحدة وقت القشور التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام محطة التقليدية أدوات التدفق. بالإضافة إلى ذلك، منذ يتم بحثها التغييرات الشاملة في حجم و / أو المحتوى الحراري، وهذه التقنيات يمكن تطبيقها على البروتينات والجزيئات الكبيرة الحيوية الأخرى التي تفتقر إلى fluorophore وأو تسمية حامل اللون. لرصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة كا 2 + ملزمة لمحولات الكالسيوم، مثل أجهزة الاستشعار الكالسيوم العصبية، وهو مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، ويعمل على الصورة الزناد زيادة سريعة (τ <20 μsec) في الكالسيوم الحرة يتم بحثها تركيز وحجم والمحتوى الحراري المرتبطة التغييرات باستخدام شعاع حراري ضوئي؛ تقنية انحراف.
Introduction
أساليب الصورة الحرارية مثل الكالوري الضوئي، شعاع حراري ضوئي؛ انحراف (PDB)، وصريف عابرة إلى جانب الإثارة الليزر النانوسيكند تمثل بديلا قويا لعابرة spectroscopies البصرية للدراسات وقت حل وسيطة قصيرة الأجل 1،2. وعلى النقيض من التقنيات البصرية، مثل امتصاص الأشعة تحت الحمراء الطيفي وعابرة، التي ترصد الشخصى الوقت من التغييرات في امتصاص حامل اللون المحيطة بها؛ تقنيات حراري ضوئي؛ كشف عن الاعتماد وقت التغييرات الحرارة / حجم، وبالتالي هي أدوات قيمة للتحقيق في وقت لمحات بصريا عمليات "الصامتة". حتى الآن، وقد تم تطبيق الكالوري الضوئي وصريف عابرة بنجاح لدراسة ديناميكية بتكوين جزئي للعمليات التي يسببها الصورة بما في ذلك الهجرة ثنائي الذرة يجند في globins 3،4، تفاعلات البروتين يجند مع مستشعر الاوكسجين FixL 5، والإلكترون والبروتون النقل في الهيم والنحاس oxidases 6 والثانية الضوئي الثاني وكذلك الصور المماكبة في رودوبسين 7 وديناميكية بتكوين جزئي في cryptochrome 8.
إلى التوسع في تطبيق التقنيات حراري ضوئي؛ لالنظم البيولوجية التي تفتقر لحامل اللون الداخلي و / أو fluorophore، تم الجمع بين تقنية PBD مع استخدام مركب قفص على الصورة الزناد زيادة في تركيز يجند / الركيزة في غضون بضع ميكروثانية أو أسرع، وهذا يتوقف على مجمع في قفص. يسمح هذا النهج رصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة يجند / الركيزة ملزمة للبروتينات التي تفتقر إلى fluorophore الداخلية أو حامل اللون وعلى الوقت النطاق التي لا يمكن الوصول إليها عن طريق الأدوات توقف تدفق التجارية. هنا طلب من PBD لرصد الديناميكا الحرارية للمجمع القفص، كا 2 + DM-nitrophen، الصور الانقسام وكذلك حركية لكا 2 + الجمعيات إلى المجال C-محطة للاستشعار الكالسيوم العصبية داونوتقدم تيار التنظيمية العنصر خصم المغير (DREAM). كا 2 + هو من كا اطلاق سراحهم الصورة 2 + DM-nitrophen في غضون 10 μsec وrebinds إلى قفص unphotolysed مع ثابت وقت ~ 300 μsec. من ناحية أخرى، في حضور apoDREAM لوحظ حدوث الحركية الإضافية التي تحدث على نطاق وميلي ثانية واحدة وقت ويعكس يجند ملزمة للبروتين. وقد تم تطبيق PBD للتحقيق التحولات متعلق بتكوين جزئي في النظم البيولوجية محدودة نوعا ما بسبب الصعوبات فعال؛ المحاذاة مثل شاقة لجنة التحقيق ومضخة شعاع لتحقيق PBD إشارة قوية وقابلة للتكرار. ومع ذلك، فإن تصميم دقيق من الأجهزة انشاء، ومراقبة دقيقة لدرجة الحرارة، والمحاذاة حذرا من لجنة التحقيق ومضخة شعاع توفير إشارة متسقة وقوية PBD التي تسمح رصد حجم الوقت حل والتغيرات في المحتوى الحراري على نطاق واسع المقياس الزمني من 10 μsec إلى ما يقرب من 200 ميللي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، modifications من إجراء التجارب لضمان الكشف عن العينة ومرجعية آثار تحت درجة حرارة متطابقة، وتكوين العازلة، والتوجه الخلايا البصرية، وقوة الليزر، الخ يخفف كثيرا من الخطأ التجريبي في حجم رد الفعل قياس والمحتوى الحراري.
Protocol
Representative Results
Discussion
مبدأ المادية وراء أساليب حراري ضوئي؛ هو أن جزيء الصورة متحمس تبدد الطاقة الزائدة عن طريق الاسترخاء الذبذبات الى ارض الدولة، مما أدى إلى التسخين الحراري من 1،12 المذيب المحيطة بها. للمذيبات مثل الماء، وهذا ينتج توسع حجم السريع (ΔV عشر). جزيئات الحالة المثارة…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (MCB 1021831، JM) وJ. & E. برنامج البحوث الطبية الحيوية (فلوريدا، قسم الصحة، JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochimie. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
