Protocol
ملاحظة: يتم سرد كافة الإمدادات في الجدول 1.
1. تخزين الأجنة الدجاج
- احتضان بيض الدجاج من سلالة جالوس جالوس أفقيا عند 37 درجة مئوية مع ما يقرب من 40٪ الرطوبة وتحويل البيض مرة أو مرتين يوميا. تحول البيض المهم لمنع الجنين من الانضمام إلى قشر البيض.
- لا لتحويل البيض في ساعة 24 قبل إنشاء ثقافة وإلا سوف يكون موجودا الجنين بطني إلى كتلة صفار البيض وسوف يكون معطوبا على فتح البيض في الخطوة 3. وبالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على البيض عند 4 درجة مئوية درجة لمدة لا تزيد على أسبوع قبل الحضانة في التنمية "وقف" ولكن هذه ليست مثالية.
2. التدريج الأجنة الدجاج
- استضافة أجنة الدجاج باستخدام همبرغر وهاميلتون 12 الجدول التدريج. مرحلة مثالية لإقامة زراعة-البيضة السابقين هي HH مرحلة 19-20 (حوالي 3- يوما من الحضانة) تيروause هذا بعد فترة وجيزة يتحول الرأس في 53 HPF.
ملاحظة: يتميز صاحب السمو مرحلة 19-20 من الصفات المورفولوجية التالية: يتم تمديد somites في الغالبية العظمى من الذيل، ولكن النهاية من الذيل يبقى unsegmented، وكرة لولبية من المهد ذيل، والسقاء صغير والأوعية الدموية محدودة، المحطة براعم هي أكبر من الجناح البراعم والعيون unpigmented أو لديها هوى رمادي.
3. إزالة الأجنة من شل
- قبل إزالة الجنين من قذيفة، رش قذيفة مع الايثانول 70٪ واتركه حتى يجف. لا تتحول البيضة بسرعة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الجنين.
- والحرص على عدم تغيير اتجاه البيض، والكراك بعناية البيض على الجانب السفلي (أي الجانب الذي كان بطني أثناء الحضانة) والافراج عن الجنين في عقيمة تزن قارب (88 س 88 × 23 ملم). مسح أسفل تزن القوارب مع 70٪ من الإيثانول. تفقد الجنين للتأكد من أن الكيس المحي غير تالف. إذا صفار حكما مكسورة، وتجاهل الجنين، كما انها لن البقاء على قيد الحياة.
- مراقبة الجنين للتأكد من أنها غير قابلة للتطبيق. كان القلب ينبض، يظهر الأوعية الدموية العادية، ولا تشوهات واضحة موجودة. تأكد من أن حواف تزن قارب جافة.
- باستخدام ماصة، وانخفاض 40 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين (5،000 وحدة البنسلين، 5 ملغ الستربتومايسين لكل مل) على أعلى من الألبومين للمساعدة في منع العدوى.
4. إعداد غرفة الرطوبة
- وضع كومة صغيرة من كيم مناديل و / أو وسادة ماصة مصنوعة من القطن في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك معقمة (12 × 12 × 6 سم) تمحى مع 70٪ من الإيثانول.
- إضافة الماء المعقم، المقطر لترطيب كيم مناديل و / أو القطن (حوالي 150 مل من الماء).
5. تجميع البيضة السابقين الثقافة
- ضع وزن القارب الذي يحتوي على الجنين في أعلى الحشو رطبة. ثم، ومكان النصف من مربع معقم بتري طبق (9.5 X 9.5 سم) على رأس ركان وزن القارب لتشكيل غطاء فضفاض.
- تغطية حاوية بلاستيكية مع غطاء لها. اضغط لأسفل ركنين من الغطاء، وضمان وجود ختم الجزئي الذي لا يزال يسمح لتدفق الهواء جيدة داخل الغرفة.
- وضع بعناية الإعداد إلى C حاضنة 37 درجة حتى المرحلة المطلوبة.
- وضع حاويات من المياه في الحاضنة للمساعدة في السيطرة على الرطوبة، وإذا حاضنة الرطوبة تسيطر عليها غير متوفرة. تعقيم جميع المياه في غرف الرطوبة والحاضنة وتجديد حسب الحاجة أثناء فترة الحضانة. 40٪ نسبة الرطوبة مثالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه البيضة السابقين الأسلوب يسمح لمراقبة الأجنة من المراحل الأولى من التنمية (HH 19/20) إلى المراحل المتأخرة للتنمية (HH 40-41) (الشكل 1A و 1B). وضع الثقافة في HH 19-20 يزيد بقاء الأجنة في الثقافة. وقبل رأسه تحول (قبل 53 HPF) البقاء على قيد الحياة ضئيلة جدا في الثقافة وبعد المرحلة 21، والجنين يميل إلى التمسك أكثر إلى قذيفة على إزالة حتى يتم الحصول على عدد أقل من الأجنة سليمة. بشكل عام، البقاء على قيد الحياة للجنين في البيضة السابقين الثقافة مرتفع يصل إلى سمو 35-36 (90-100٪)، ولكنها قطرة في مراحل أكثر تقدما للتنمية (حوالي 40٪ البقاء على قيد الحياة لسمو 40-41). بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أنه قد ثبت أن التنمية يبدو وضعها الطبيعي في هذه المراحل المتأخرة والزخرفة الهيكل العظمي لا يتأثر 4،15، لاحظنا أن الأطراف يعكفون في هذه المراحل المتأخرة مما يشير إلى أن درجة أو توقيت التحجر قد تتأثر. هذا هوليس من المستغرب النظر في الحاجة إلى الكالسيوم من قذيفة لالتحجر. هي مقارنة مفصلة لتطور الجنين مقارنة مع الضوابط جارية وهي خارج نطاق هذه الورقة الأساليب.
الحصول على إمكانية الوصول إلى الجنين طوال تنمية المهم لسببين رئيسيين. أولا والباحثين قادرين على عرض تنمية على أساس يومي دون الحاجة إلى فضها وختم نافذة. على سبيل المثال، والأفراد قادرين على مراقبة أطرافهم والتنمية العين في مراحل متعددة (الشكل 1C و1D). ثانيا، البيضة السابقين زراعة يتيح إمكانية أكبر للوصول (غير مقيد) إلى الجنين، وبالتالي تمكين التلاعب أسهل أو العمليات الجراحية.
التلاعب الجنينية في معظم الأحيان، والحاجة إلى أن يقوم باستخدام stereomicroscope. باستخدام البيضة السابقين طريقة زراعة الموصوفة هنا بدلا من الستايروفوم طريقة / الاغطية البلاستيكية 6،7،8 الجنين يتم وضعها انشاء بسهولة اوندإيه المجهر، هو أقل عمقا ولن تنقلب. وهذا يتيح للباحث لوضع غرفة الرطوبة بدقة حسب الحاجة وتناوب عليها لتحسين الوصول إلى الجنين، حيث لا توجد حواجز (قشرة البيضة) التعتيم على الجنين ومنذ غرفة مستقرة جدا. وعموما، فإن الدعم الذي يتلقاه الجنين من وزن القارب يسمح ضغط لطيف ليتم تطبيقها على الجنين خلال التلاعب دون الإعداد السقوط.
ويمكن إجراء عدة طرق البيولوجيا التنموية على الأجنة في هذا النظام الثقافة. وتشمل هذه الملاحظات التفصيلية لجهاز (على سبيل المثال، والعين، وغيرها الدماغ) أو تطوير الأنسجة (على سبيل المثال، نمو الأوعية الدموية) أو تطبيق وكلاء ماسخة. وتشمل التلاعب تطعيم الأنسجة على الأغشية سقائية مشيمائية لدراسة تأثير الجمع بين طبقات الأنسجة المختلفة أو دراسة نمو الورم والانبثاث 14. آخر التلاعب شعبية يؤديها خلال التنمية هو BEAد أو حاجز زرع. زرع حبة يسمح الباحث لامتصاص المانع أو عامل على حبة ثم زرع حبة محليا لمنع أو حث الجينات محليا في مجال الاهتمام. وغالبا ما يتم ذلك باستخدام affigel أو الهيبارين الخرز (الشكل 2A). على سبيل المثال، العظام البروتينات التخلق (أفضل الممارسات الإدارية) يمكن تثبيط محليا خلال تحريض قمة العصبية المشتقة العظام 4، 15، أو في براعم الأطراف النامية 13. بعد زرع حبة، ويمكن إرجاع الجنين إلى الحاضنة، وسوف تستمر في التطور. هذا يسمح للباحثين لعرض الآثار المصب من تثبيط جينات معينة (في هذه الحالة BMP)، مثل تثبيط تشكيل عظيمات الصلبة في الحلقة المتصلبة (الشكل 2B و2C) 15. وبالمثل، والحواجز ويمكن بسهولة أن يدرج بين طبقات الأنسجة من أجل دراسة الأنسجة إلى أنسجة الإشارات ويمكن ايضا بسهولة ان أجرى Microinjection من الأصباغ. 
الشكل 1. الاطلاع على البيانات الشخصية والبيضة جنين السابق. (A) مرحلة HH 20 فرخ جنين بعد إزالة من قذيفة، ونقاط السهم إلى الجنين مع الأغشية الجنينية أوعية دموية. (ب) HH المرحلة 40 الجنين في غرفة الرطوبة المفتوحة. (C) سمو مرحلة 35 الجنين تظهر براعم الأطراف في وقت مبكر (السهم). (D) المرحلة HH 41 الجنين تظهر تطور مرحلة لاحقة من هياكل مثل العين (السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مثال على رأس غارقة حبة زرع Experimوالأنف والحنجرة (4). (A) الأجنة سمو مرحلة 35 كشفت من خلال ثقب صغير مزقتها في الأغشية المغطي من أجل الوصول إلى العين الأساسية للحبة زرع. ويظهر تضخم عالية من حبة affigel المجاورة لحليمة الملتحمة في أقحم. شريط النطاق في C هو 75 ميكرون. (ب) الفوسفاتيز القلوية ملطخة العين اليمنى بعد زرع رأس حبة (السهم) تظهر فجوة في حلقة العظيمات، HH 38 (C) AP الملون العين اليسرى ولم تظهر أي اختلال في حلقة من العظيمات (مراقبة )، وتقدم سمو 38. تفاصيل هذه التجربة في Duench وفرانز Odendaal 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البيضة السابقين زراعة ووضع النوافذ على حد سواء لها مزايا وتحديات. نحن هنا مقارنة المزايا والتحديات من الكأس السابق الستايروفوم البيضة طريقة وأسلوب النوافذ لدينا سابقا الأمثل البيضة الطريقة هو موضح هنا. لدينا وسيلة تمكن التلاعب والمراقبة سهلة للجنين الفرخ في المراحل المتأخرة من التطوير والتحسينات جهدنا لالسابقين التقليدي البيضة طريقة 1، 2، 3 جعلها بالإضافة إلى ذلك من السهل جدا للاستخدام في الفصول مختبر التدريس الجامعية.
على الرغم من أن العديد من الباحثين يفضلون أسلوب النوافذ لدراسة تطوير الدجاج لأنها بسيطة لأداء ولها البقاء ممتازا لمراحل متأخرة للتنمية (HH 41-42)، له حدود. أكبرها هي قدرة محدودة لعرض الجنين بأكمله بعد HH المرحلة 30. وبعد مرحلة HH 30، يحتاج نافذة في قشر البيض إلى أن تكون كبيرة للغاية من أجل عرض المتنامية، والانتقال الجنين. هذه نافذة كبيرة هو فرقicult لختم تماما (مما يؤدي إلى مشاكل مع العقم والبقاء على قيد الحياة)، والحصول على إضاءة جيدة داخل البويضة يمكن أن يكون تحديا. وبالإضافة إلى ذلك، الأجنة مرحلة متقدمة كبيرة ويصعب الوصول إليها (أو التلاعب) من خلال النافذة.
والبيضة السابقين الطريقة الموصوفة هنا يوفر وصولا غير مطروقة الكامل للجنين. مرة واحدة يتم وضع تزن قارب في غرفة الرطوبة، كامل مجموعة المتابعة هو مستقر للغاية. يمكن وضعها في غرفة الرطوبة كلها تحت المجهر تشريح وتضخم عالية يمكن استخدامها لمراقبة الجنين بأكمله. وبالمقارنة، فإن الطريقة كوب الستايروفوم لديه غرفة الرطوبة هو طويل القامة (الطول كوب) وهذا يجعل من الصعب جدا لوضع إطار الأهداف المجهر. تصميم الكأس هي أيضا أقل استقرارا بكثير من شقة وزن القارب ويمكن بسهولة أن طرقت هذه الكؤوس من جديد. لدينا تحسينات على البيضة السابقين طريقة تجعل هذه الطريقة واضحة لاستخدامها في إعداد الفصول الدراسية أو المختبرات وتمكن الحاديudent لديك حق الوصول الكامل إلى الأجنة من مرحلة HH 19 من خلال لسمو 40؛ مراحل عندما توالد كبير يحدث. وأكبر عيب من السابق لدينا البيضة الأسلوب هو العقم. من أجل منع العدوى، ويشمل أسلوبنا إضافة المضادات الحيوية. يمكن إعطاء جرعة أخرى من المضادات الحيوية للجنين في مراحل لاحقة. كما لا يظهر المضادات الحيوية تدار خلال ثقافة انشاء أن تؤثر على تطور الجنين. تعقيم الحاويات مع الايثانول 70٪ قبل استخدامها يمكن أن تزيد بشكل كبير البقاء على قيد الحياة.
وعموما، فإن البيضة السابقين الطريقة مثالية للعرض والتلاعب الأجنة دون قيود على وصول أو مرحلة من مراحل التنمية. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن زراعة الأجنة البيضة السابقين لا يؤثر سلبا الزخرفة 4،15. على سبيل المثال، نحن لا نرى أي تغييرات في الزخرفة أو تحريض الهيكل العظمي على الرغم من عدم وجود قشر البيض. لدينا تحسين طريقة يحل متعددة جhallenges موجودة مع السابقين التقليدي الحالي البيضة طريقة 1،2، 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة في ما يخص المعلومات الواردة في هذه المخطوطة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر بول بوارييه، ومنتج وسائل الإعلام، في جبل جامعة سانت فنسنت لعمله في تصوير وتحرير جزء الفيديو من هذه المخطوطة. ونحن نعترف العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا للحصول على التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
