Protocol
注：所有用品都列在表1中。
1.存放鸡胚
- 孵育应变鸡水平鸡在37℃，大约40％的湿度的鸡蛋，把鸡蛋一次或每天两次。翻蛋重要的是要防止胚胎附着在蛋壳。
- 不打开鸡蛋在24小时之前，建立培养另有胚胎将位于腹侧蛋黄的质量和在打开鸡蛋在步骤3除了将被损坏，保持蛋在4℃下度孵化，以“叫停”开发前不超过一个星期，但这种不理想。
2.分期鸡胚
- 舞台采用汉堡和汉密尔顿12临时表中的鸡胚。设立的前OVO培养的理想阶段是HH阶段19-20（约3-天的潜伏期），BEC澳洲英语这是头转向后不久，在53高倍视野。
注意：HH阶段19-20的特征在于用以下形态学性状：体节延伸到大多数的尾部，但是尾部的最末端保持不分段，尾芽卷曲，尿囊小并且具有有限的脉管，腿芽比翼芽大，眼睛是未染色的，或有一个灰色的色调。
3.从外壳取下胚胎
- 之前从外壳取出胚胎，喷壳用70％乙醇，并允许其干燥。不要把鸡蛋迅速，因为这会损坏胚胎。
- 小心不要改变卵的取向，小心裂纹蛋上的下侧（即，侧那孵育期间腹侧），并释放该胚胎到无菌称量船（约88 x 88×23毫米）。擦拭称量皿，用70％的乙醇。检查胚胎，以确保黄麻袋不被损坏。如果蛋黄ħ作为破碎，放弃胚胎，因为它会无法生存。
- 观察胚胎，以确保它是可行的;心脏跳动，血管显示正常，未见明显异常存在。确保称量船的边缘是干燥的。
- 使用移液管，滴40微升青霉素/链霉素（5,000单位青霉素，每毫升5毫克链霉素）上的白蛋白的顶部，以防止感染。
4.准备恒温恒湿箱
- 放置一小叠KIM-湿巾和/或在无菌的塑料容器（12×12×6厘米）的底部由棉的吸收垫擦拭用70％的乙醇。
- 加无菌蒸馏水弄湿KIM-湿巾和/或棉（约150毫升水）。
5.装配防爆大毛文化
- 将含在潮湿的填充顶部胚胎的权衡船。然后，将半方形无菌培养皿（9.5×9.5厘米）对T顶部他权衡船，形成一个松散的盖子。
- 覆盖塑料容器，其盖子。向下压在盖的两个角，从而确保一局部密封，其仍然允许该腔室内部的良好的气流。
- 小心地将设置到37℃培养箱，直到所需的阶段。
- 放置的水的容器，在培养箱中以帮助控制湿度，如果一个受控湿度培养箱不可用。消毒所有的水在湿室和孵化器和发病期间根据需要及时补充。 40％的湿度是理想的。
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Representative Results
这当然大毛方法可以从开发的初期阶段（HH 19/20），观察胚胎的发展（ 图1B和1A），后期（HH 40-41）。建立文化的HH 19-20增加了文化的胚胎存活。在此之前的头部转动（前53 HPF）生存能力是很低的文化和级21之后，胚胎往往如此少完整胚获得更粘到上除去外壳。在一般情况下， 前OVO文化的胚胎生存能力更是高达35-36 HH（90-100％），但它确实下降的发展更高级阶段（约40％生存到HH 40-41）。另外，尽管已经显示，发展出现正常在这些晚期和骨架的图案形成不受影响4,15，我们已经观察到四肢弯曲这些后期表明骨化的程度或定时可能会受到影响。这是并不奇怪，考虑是否需要补钙从壳骨化。与对照组相比胚胎发育的详细对比正在进行，超出了本文的方法的范围。
获得进入整个胚胎的发展主要有两个重要的原因。首先，研究人员能够查看发展，每天无需启封并重新密封的窗口。例如，个人都能够观察肢体和眼睛发育的多个阶段（ 图1C和1D）。其次， 前大毛培养能够取得更大的（无限制）进入胚胎，从而使操作更加容易，或手术。
胚胎操作次数最多，需要使用立体显微镜来进行。使用前卵此处所描述，相对于泡沫塑料/保鲜方法6,7,8培养方法胚胎建立易于UND放置呃显微镜，还不深，不会翻倒。这使得研究者能够根据需要并旋转它来优化获得的胚胎精确地定位的恒湿室中，由于不存在障碍（蛋壳）混淆胚胎，并且由于腔室是非常稳定的。总体而言，胚胎接收来自称量舟的支持允许温和的压力被操纵期间没有集式翻倒施加到胚胎。
几个发育生物学方法可以在这种文化体系中的胚胎进行。这些措施包括器官的详细观察（ 如眼，脑等）或组织发展（ 如，血管生长）或应用程序的致畸剂。操纵包括组织上的绒毛尿囊膜的接枝来研究组合不同的组织层或学习肿瘤生长和转移14的效果。在开发过程中进行的另一种流行的操控是BEAd或屏障植入。珠注入允许研究者浸泡抑制剂或因子到胎圈，然后植入珠局部地抑制或在感兴趣的区域局部地诱导基因。这通常是用AffiGel或肝素珠（ 图2A）。例如，骨形态发生蛋白（BMPs），可以局部地诱导神经嵴源性骨4,15期间抑制，或在显影肢芽13。后的珠被植入，胚胎可以放回培养箱，它会继续发展。这使得研究人员能够查看特定基因的抑制（在这种情况下，BMP），下游效应，如巩膜听小骨的形成，在硬化环的抑制（ 图2B和2C）15。同样，屏障可以容易地组织层之间，以便研究组织到组织信令和染料的显微注射也可以很容易地进行插入。 
图1.查看胚胎前OVO。（A）HH阶段去除后壳20鸡胚，箭头指向与血管胚胎膜的胚胎。（B）一个HH阶段40胚胎在一个开放的湿度室。（C） HH阶段35胚胎早期呈现肢芽（箭头）。（D）阶段HH 41胚胎显示后期发展结构，如眼睛（箭头）。 请点击此处查看该图的放大版本。
头蛋白图2.示例浸泡珠植入ExperimENT 4（A）胚胎HH阶段35通过一个小孔撕开的覆膜，以获得潜在的眼睛珠子植入暴露。高倍率邻近结膜乳头的affigel珠粒示于插图。在C中比例尺为75微米。（B）碱性磷酸酶染色右眼后，头蛋白珠植入（箭头），显示差距小骨的戒指，HH 38（C）AP染色左眼呈现给听小骨的环不会中断（控制），HH这个实验38.详细情况Duench和弗朗兹- Odendaal 4提供。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
前大毛培养和窗口都有优点和挑战。在这里，我们比较一下优点和泡沫塑料杯前卵内的方法和开窗的方法对我们的优化卵内的方法当然在这里显示的挑战。我们的方法能够操纵和便于观察小鸡胚胎在发育的后期阶段，我们的改进传统的前卵方法1，2，3，使其附加地很容易在本科教学实验室类使用。
虽然许多研究人员更加窗方法来研究鸡发展，因为它是简单的执行，并具有极好的可生存的发展晚期（HH 41-42），它有局限性。其中最大的是能力有限，查看HH阶段30后，整个胚胎阶段后HH 30，在蛋壳的窗口需要是为了查看越来越大，移动的胚胎非常大。这个大窗口的difficult密封完全（导致问题的不育和生存能力），并取得良好的照明蛋内是具有挑战性的。此外，晚期胚胎是通过窗口大而难以进入（或操纵）。
大毛方法前这里描述提供了完整的不羁进入胚胎。一旦称重舟放置在湿度室中，整个的建立是非常稳定的。整个湿度箱可以放置在解剖显微镜下和高放大倍数可以用于观察整个胚胎。相比较而言，该泡沫聚苯乙烯杯法具有湿度室，其是高（杯高度），这使得它在显微镜下的目标放置非常困难。杯子的设计也远远比平面不太稳定的权衡船，这些杯子很容易被打翻。我们对前OVO方法的改进让这个简单的方法在教室或实验室环境中使用，使STudent有通过对HH 40全面进入从舞台HH 19胚胎;当主要器官发生阶段。我们前大毛方法的最大缺点是不育。为了防止感染，我们的方法包括在加入抗生素。抗生素的另一种剂量可在稍后阶段给予胚胎。在培养建立施用抗生素也似乎不影响胚胎的发育。灭菌容器一起使用可以显着提高的生存能力现有的70％的乙醇。
总体而言， 前大毛方法最适用于查看和操作胚胎不会对接入的发展或舞台限制。以前的研究已经表明，培养所述胚卵前不会负面构图4,15影响。例如，我们没有看到在图案化或诱导的骨架的任何变化，尽管没有蛋壳。我们的改进方法解决了多ç与当前的传统前卵方法1,2，3存在hallenges。
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Disclosures
笔者在对在这个手稿所提供的信息没有竞争经济利益。
Acknowledgments
我们要感谢保罗·普瓦里耶，媒体制作，在圣文森特山大学为他的拍摄工作和编辑这篇稿子的视频部分。我们承认自然科学加拿大与工程研究理事会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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