Protocol
참고 : 모든 소모품은 표 1에 나열되어 있습니다.
1. 닭 배아를 저장
- 약 40 %의 습도 루스가 37 ℃로 수평 루스 균주의 닭 알을 품어 한 번 또는 두 번 매일 계란을 켭니다. 달걀을 돌리면 껍질에 부착 배아를 방지하는 것이 중요하다.
- 4 O C에서 계란을 유지, 이전에, 그렇지 않으면 배아는 노른자 질량에 복부를 위치 할 것이며, 또한 3 단계에서 계란을 여는 손상되는 바와 같이 문화를 설정하여 24 시간에 계란을 설정하지 마십시오 "정지"개발에 배양하기 전에 이하 1 주일도하지만이 적합하지 않습니다.
2. 닭 배아를 준비
- 햄버거와 해밀턴 (12) 스테이징 테이블을 사용하여 닭 배아를 스테이지. 전 비켜 배양를 설정하는 이상적인 단계는 HH 단계 19 ~ 20 (배양 3 약 일) 벡입니다ause이는 머리가 53 HPF에서 전환 직후입니다.
주 : HH 단계 19-20는 다음의 형태 학적 특성을 특징으로한다 : somites 꼬리의 과반수로 연장되어 있지만, 꼬리의 끝은 꼬리 봉오리가 말려, 비분 남아 allantois이 작고 맥관 한계가 다리 싹이 날개 - 싹이보다 큰하고 눈은 착색 또는 회색 빛 색조를 가지고있다.
3. 쉘에서 배아를 제거
- 쉘에서 배아를 제거하기 전에, 70 % 에탄올로 쉘을 스프레이하고 건조 할 수 있습니다. 이 배아를 손상되므로 신속하게 계란을 끄지 마십시오.
- 조심하는 것은 조심스럽게 아래쪽에 계란을 균열, 달걀의 방향을 변경하지 (즉, 배양 중에 복부이었다 측)과 멸균에 배아를 해제 보트 (88 X 88 X 23mm)에 무게. 닦아 70 % 에탄올 보트의 무게. 노른자 자루가 손상되지 않았는지 확인하기 위해 배아를 검사합니다. 노른자 시간의 경우깨진로 생존하지 않으므로, 배아를 폐기합니다.
- 그것이 가능한 지 확인하기 위해 배아를 관찰; 심장 박동, 혈관은 정상 나타나고, 명백한 이상이 존재하지 않습니다. 무게 보트의 가장자리가 건조되었는지 확인합니다.
- 피펫을 사용하여 감염을 방지하기 위해 알부민의 상단에 페니실린 / 스트렙토 마이신의 40 μL (5,000 단위의 페니실린, 1 mL 당 5 mg을 스트렙토 마이신)를 놓습니다.
4. 습도 챔버 준비
- 킴 와이프 - 및 / 또는 멸균 플라스틱 용기 (12 X 12 X 6cm)의 바닥면으로 이루어지는 흡수 패드의 작은 스택을 놓고 70 % 에탄올로 닦았다.
- 김 와이프 및 / 또는면 (물 약 150 ml)에 축축하게 멸균 증류수를 추가합니다.
5. 예 비켜 문화 조립
- 축축한 패딩의 상단에있는 배아를 포함하는 무게 보트를 놓습니다. 그런 다음, t의 상단에 사각형 멸균 페트리 접시 (9.5 X 9.5 cm)의 장소 반그는 느슨한 뚜껑을 형성하기 위해 보트의 무게.
- 그 뚜껑이있는 플라스틱 용기를 커버. 여전히 챔버 내부에 좋은 공기 흐름을 허용하는 부분 도장을 보장, 뚜껑의 두 모서리를 누르십시오.
- 조심스럽게 원하는 단계까지 37 O를 C 배양기에 설치를 놓습니다.
- 제어 습도 배양기를 사용할 수없는 경우, 습도를 제어 할 수 있도록하기 위해 인큐베이터에서 물 용기를 놓습니다. 습도 챔버 및 배양기에서 모든 물을 소독 잠복기 동안 필요에 따라 보충. 40 %의 습도가 이상적입니다.
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Representative Results
방법 비켜이 전 늦게 개발의 단계 (HH 40 ~ 41) (그림 1A 및 1B)에 개발의 초기 단계 (HH 19/20)에서 배아의 관찰이 가능합니다. HH 19 ~ 20에서 문화를 설정하는 것은 문화의 배아의 생존을 증가시킨다. 생존의 문화와 단계 (21) 후 매우 낮은 (53 HPF 전) 선회 머리 이전에, 배아 적은 그대로 배아가 얻어진다 있도록 분리에 쉘에 더 집착하는 경향이있다. (약 40 % HH 40-41로 생존) 일반적으로, 문화 비켜 전에서 배아의 생존은 HH 35 ~ 36 (90~100%)에 높은이지만, 그것은 개발의 고급 단계에 드롭을한다. 그것은 그 발전을 보여왔다 있지만 또한 이러한 후반 단계에서 정상 나타나고 골격의 패터닝 4,15 영향을받지 않습니다, 우리는 사지 골화의 정도 또는 타이밍에 영향을 미칠 수있는 제안이 늦은 단계에서 구부러진 것을 관찰했다. 이다놀라운 일이 아니다 골화에 대한 쉘에서 칼슘의 필요성을 고려. 대조군과 비교 배아 발달의 상세한 비교가 진행 중이고,이 방법 종이의 범위를 벗어난다.
개발 전반에 걸쳐 배아에 대한 액세스를 얻는 것은 두 가지 이유에서 중요하다. 첫째로, 연구자들은 개봉 및 재 밀봉 창 않고도 매일 현상을 볼 수있다. 예를 들어, 개인은 여러 단계 (그림 1C 및 1D)에서 사지 눈의 발달을 관찰 할 수 있습니다. 둘째, 배양 비켜 예는, 태아에 이상 (무제한) 액세스 할 수 있도록함으로써 쉽게 조작 또는 수술을 가능하게한다.
배아 조작은 흔히, 실체 현미경을 사용하여 수행 될 필요가있다. 스티로폼 / 플라스틱 포장 방법 6,7,8 반대로 여기에 설명 배양 방법 비켜 예를 사용하여 설정을 쉽게 싶게 배치 된 배아어 현미경은 덜 깊은 전복되지 않습니다. 배아를 모호하게하는 어떠한 장벽 (난각)이 없기 때문에, 상기 챔버는 매우 안정하기 때문에이 필요하고 배아 액세스를 최적화하기를 회전하도록 정확하게 습도 챔버를 위치시키기 위해 연구를 가능하게한다. 전반적으로, 배아로부터받는 계량 보트 지지체는 약간 힘이 셋업은 축출없이 조작 중에 배아에 적용 할 수있다.
몇몇 발생 생물학 방법이 배양 계에서 배아에 대해 수행 될 수있다. 다음은 상세한 기관의 관찰 (예를 들면, 눈, 뇌 등) 또는 기형 에이전트의 조직 개발 (예를 들면, 혈관 성장) 나 응용 프로그램을 포함한다. 조작은 다른 조직 계층을 결합 또는 종양의 성장과 전이 (14) 공부의 효과를 연구하기 위해 융모 막 상 조직의 이식을 포함한다. 개발 과정에서 수행 인기있는 또 다른 조작은 BEA이다d 또는 장벽 주입. 비드 주입 연구원이 억제하거나 관심의 영역에서 로컬 유전자를 유도하기 위해 로컬 비드를 비드에 억제제 또는 요소를 흡수 한 후 이식 할 수 있습니다. 또이 문제는 아피 겔 또는 헤파린 비즈 (그림 2A)를 사용하여 수행됩니다. 예를 들어, 뼈 형태 형성 단백질 (BMP 형식)은 로컬 뼈 4 유래 신경 능선 (15)의 유도를 억제 할 수있는 동안, 또는 현상 상지에서 13 새싹. 비드 이식 후 배아 인큐베이터로 복귀 될 수 있으며, 이는 지속적으로 개발하는 것이다. 이 연구원은 경화성 반지의 공막, 이소골 형성의 억제 (그림 2B 및 2C) (15) (이 경우 BMP)에 특정 유전자의 억제의 하류 효과를 볼 수 있습니다. 유사하게, 장벽은 쉽게 조직 간 조직 시그널링 및 염료의 미세 주입법은 또한 용이하게 행할 수를 연구하기 위해 티슈 층 사이에 삽입 될 수있다. 
배아의 전 비켜보기 그림 1. (A) HH 단계 쉘에서 제거 후 20 병아리 배아, 혈관 배아 멤브레인 배아에 화살표가. (B) HH 단계 오픈 습도 챔버에서 40 배. (C) HH 단계 초기 사지 싹 (화살표)를 보여주는 35 배. (D) 등의 눈 (화살표)와 같은 구조의 나중 단계 개발을 보여주는 무대 HH 41 배. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
소량의 그림 2. 예 주입 Experim 비드 배어ENT 4. (A) 배아 HH 스테이지 (35)는 비드 주입 하부 눈에 액세스하기 위해 위에 놓이는 멤브레인에서 찢어진 작은 구멍을 통해 노출. 결막 유두 인접 아피 겔 비드 고배율 인셋에 나타낸다. C의 스케일 바는 75 μm의입니다. (B) 알칼리 포스 파타 아제가 이소골의 반지의 격차를 보여주는 소량 비드 주입 (화살표), 이소골의 반지에 더 혼란을 보여주는 HH 38 (C) AP 스테인드 왼쪽 눈 (제어 후 오른쪽 눈 스테인드 )이 실험의 38 상세 Duench 프란츠 - Odendaal 4에서 제공되는 HH는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
배양을 모두 윈도 비켜 예 장점과 도전이있다. 여기에서 우리는 장점과 방법 비켜 스티로폼 컵 전 아래에 표시된 방법 비켜 우리의 최적화 된 예에 윈도우 방법의 문제를 비교합니다. 우리의 방법은 늦게 개발의 단계 및 방법 1, 2 비켜 전통적인 예에 대한 우리의 개선에 조작과 병아리 배아를 관찰 할 수 있도록, 3 학부 교육 실험실 클래스에서 사용하는 것이 또한 매우 간단합니다.
이 수행 할 간단하고 개발의 후반 단계 (HH 41 ~ 42)에 우수한 생존 성을 가지고 있기 때문에 많은 연구자들이 닭 개발을 연구하기 위해 윈도우 방법을 선호하지만, 그것은 한계가있다. 그 중 가장 큰 무대 후 HH (30) HH 단계 (30) 후 전체 배아를 볼 수있는 제한된 능력이다, 달걀 껍질에있는 창은 성장, 이동 배아를 이용하기 위해서는 매우 큰 필요가있다. 이 대형 윈도우는 DIFF입니다icult 완전히 (불임과 생존의 문제로 이어지는), 도전 할 수있는 계란 내부에 좋은 조명을 얻기 밀봉합니다. 또한, 고급 단계의 배아는 창을 통해 크고 어려운 액세스 (또는 조작)입니다.
여기에 설명 된 방법 비켜 전 배아에 대한 모든 자유로운 액세스를 제공합니다. 계량 보트 습도 챔버에 배치되면, 전체 셋업은 매우 안정하다. 전체 습도 챔버 해부 현미경 아래에 배치 될 수 있고, 고배율은 전체 배아를 관찰하는데 사용될 수있다. 이에 비해, 스티로폼 컵 방법 높이 습도 챔버 (컵 높이)를 가지며, 이것은 매우 어려운 목표 현미경 하에서 배치 할 수있다. 컵 디자인은 보트의 무게도 훨씬 덜 안정된 평면보다 이러한 컵은 쉽게 뒤집히는 할 수 있습니다. 방법 비켜 예에 대한 우리의 개선은 교실이나 실험실 환경에서 사용하는이 방법은 간단하고 보안 목표 명세서를 할 수 있습니다HH (40)에 이르기까지 단계 HH 19 배아에 대한 모든 권한을 가지고 udent; 주요 기관 형성이 발생하면 스테이지. 방법 비켜 우리의 전직의 가장 큰 단점은 불임이다. 감염을 예방하기 위해, 우리의 방법은 항생제의 첨가를 포함한다. 항생제의 투여 량은 이후 또 다른 단계에서 배아를들 수있다. 배양 셋업 동안 투여 항생제는 배아 발달에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 극적으로 생존 성을 높일 수 있습니다 사용하기 전에 70 % 에탄올로 용기를 살균.
전반적으로, 방법 비켜 전 개발의 접근이나 무대에 제한없이 배아를보고하고 조작하기에 이상적입니다. 이전 연구는 배아에게 전 비켜을 배양하는 것은 부정적인 4,15을 패턴에 영향을주지 않는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 우리는 달걀 껍질의 부재에도 불구하고 패터닝 또는 골격의 유도에 어떤 변화를 볼 수 없습니다. 우리의 개선 방법은 여러 C를 해결방법 1, 2, 3 인 오보 전류 전통적인 EX와 병행 hallenges.
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Disclosures
저자는이 논문에서 제시된 정보에 관해서 더 경쟁 금융 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 자신의 촬영에서 작업이 원고의 비디오 부분을 편집 마운트 세인트 빈센트 대학의 폴 포이 리어, 미디어 프로듀서, 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 자금에 대한 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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