Protocol
Remarque: Toutes les fournitures sont énumérées dans le tableau 1.
1. Stockage du poulet embryons
- Incuber des œufs de poule de la souche Gallus gallus horizontalement à 37 o C avec environ 40% d'humidité et tourner oeufs une ou deux fois par jour. Mise oeufs est important de prévenir l'embryon d'adhérer à la coquille.
- Ne pas tourner l'œuf dans le 24 heures avant la mise en place de la culture contraire l'embryon sera situé ventrale à la masse de jaune et sera endommagé lors de l'ouverture de l'œuf à l'étape 3. En outre, garder les œufs à 4 o C degrés pour pas plus d'une semaine avant l'incubation au développement "d'arrêt", mais ce ne est pas idéal.
2. Mise en scène embryons de poulet
- Stade, les embryons de poulet en utilisant le Hamburger et Hamilton 12 table intermédiaire. L'étape idéale pour la mise en place de la culture ex-ovo est HH stade 19-20 (autour de 3 jours d'incubation) because ce est peu de temps après que la tête tourne à 53 HPF.
Remarque: étape HH 19-20 est caractérisé par les traits morphologiques suivantes: somites sont étendues dans la majorité de la queue, mais la fin de la queue reste non segmenté, la queue bourgeon est gondolé, l'allantoïde est petite et le système vasculaire a limité, les jambes bourgeons sont plus grandes que les ailes bourgeons et les yeux sont non pigmentée ou avoir une teinte grisâtre.
3. Retrait de l'embryon de la Shell
- Avant de retirer l'embryon de la coquille, pulvériser la coquille avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Ne mettez pas l'œuf rapidement car cela pourrait endommager l'embryon.
- En faisant attention de ne pas modifier l'orientation de l'œuf, le crack attentivement l'œuf sur le côté inférieur (ce est à dire, le côté qui était ventrale pendant l'incubation) et libérer l'embryon dans une stérile pèsent bateau (88 x 88 x 23 mm). Essuyez peser bateaux avec 70% d'éthanol. Inspectez l'embryon de se assurer que le sac jaune ne est pas endommagé. Si le jaune hcomme cassé, jetez l'embryon, comme il ne survivra pas.
- Observer l'embryon pour se assurer qu'il est viable; le cœur bat, vasculaire semble normal, et aucune anomalie évidente sont présents. Veiller à ce que les bords du bateau peser sont secs.
- En utilisant une pipette, déposer 40 pi de pénicilline / streptomycine (5000 unités de pénicilline, la streptomycine 5 mg par ml) sur le dessus de l'albumine pour aider à prévenir l'infection.
4. Préparer la Chambre Humidité
- Placer une petite pile de KIM-lingettes et / ou un tampon absorbant en coton dans le fond d'un récipient en plastique stérile (12 x 12 x 6 cm) essuyés avec 70% d'éthanol.
- Ajouter l'eau distillée stérile pour humidifier les Kim-lingettes et / ou de coton (environ 150 ml d'eau).
5. Assemblage de l'Ex Ovo Culture
- Placer le bateau peser contenant l'embryon au-dessus du rembourrage humide. Ensuite, placez la moitié d'une boîte de Pétri stérile carré (9,5 x 9,5 cm) au-dessus de til pèse bateau pour former un couvercle lâche.
- Couvrir le récipient en plastique avec son couvercle. Appuyez deux coins du couvercle, assurant une étanchéité partielle qui permet encore pour une bonne circulation de l'air intérieur de la chambre.
- Placez délicatement la configuration dans le 37 o C incubateur jusqu'au stade désiré.
- Placer les conteneurs d'eau dans l'incubateur pour aider à contrôler l'humidité, si un incubateur à humidité contrôlée ne est pas disponible. Stériliser toute l'eau dans les chambres de l'humidité et dans l'incubateur et de reconstituer au besoin pendant la période d'incubation. 40% d'humidité optimal.
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Representative Results
Cette ex ovo méthode permet pour l'observation des embryons de stade précoce de développement (HH 19/20) à un stade avancé de développement (HH 40-41) (figure 1a et 1b). Mise en place de la culture à HH 19-20 augmente de survie des embryons dans la culture. Avant la rotation de la tête (avant 53 HPF) de survie est très faible dans la culture et après l'étape 21, l'embryon a tendance à coller davantage à la coquille sur l'élimination de façon moins d'embryons intacts sont obtenus. En général, la capacité de survie de l'embryon dans l'ex ovo la culture est élevé jusqu'à HH 35-36 (90-100%), mais elle baisse dans les stades plus avancés de développement (environ 40% survivent à HH 40-41). En outre, bien qu'il ait été montré que le développement apparaît normal à ces stades tardifs et la structuration du squelette ne est pas affecté 4,15, nous avons observé que les membres sont pliés à ces stades tardifs suggérant que le degré ou le calendrier d'ossification peuvent être affectées. Ce estpas surprenant compte tenu de la nécessité pour le calcium de la coquille pour l'ossification. Une comparaison détaillée du développement de l'embryon par rapport aux témoins est en cours et est au-delà de la portée de ce document sur les méthodes.
Obtenir l'accès à l'embryon au cours du développement est important pour deux raisons principales. Premièrement, les chercheurs sont en mesure de voir le développement sur une base quotidienne sans avoir à descelle et refermer une fenêtre. Par exemple, les individus sont en mesure d'observer membre et développement de l'œil à plusieurs étapes (figure 1C et 1D). Deuxièmement, ex ovo culture permet un plus grand accès (sans restriction) à l'embryon, ce qui permet des manipulations ou des interventions chirurgicales plus faciles.
Manipulations embryonnaires plus souvent, doivent être effectuées en utilisant un stéréomicroscope. Utilisation de l'ex ovo méthode de culture décrit ici par opposition à la méthode / de pellicule plastique polystyrène 6,7,8 l'embryon set-up est facilement placé under au microscope, est moins profonde et ne sera pas basculer. Cela permet au chercheur de positionner la chambre d'humidité précisément que nécessaire et pour la faire tourner pour optimiser l'accès à l'embryon, car il n'y a pas d'obstacles (de coquille d'oeuf) obscurcissant l'embryon et depuis la chambre est très stable. Dans l'ensemble, le soutien de l'embryon reçoit du bateau peser permet une légère pression à appliquer à l'embryon pendant la manipulation sans le set-up basculer.
Plusieurs méthodes de biologie du développement peuvent être effectuées sur les embryons dans ce système de culture. Il se agit notamment des observations détaillées des organes (par exemple, des yeux, du cerveau, etc.) ou le développement du tissu (par exemple, la croissance des vaisseaux sanguins) ou l'application d'agents tératogènes. Manipulations comprennent greffage de tissus sur les membranes chorio pour étudier l'effet de la combinaison de couches de tissus différents ou d'étudier la croissance tumorale et les métastases 14. Un autre manipulation populaire effectué durant le développement est bead ou une barrière implantation. Perle implantation permet à un chercheur de faire tremper un facteur inhibiteur ou sur la bille et la bille alors implanter localement pour inhiber ou induire les gènes localement dans la zone d'intérêt. Cela se fait souvent à l'aide AffiGel ou héparine perles (figure 2A). Par exemple, les protéines morphogénétiques osseuses (BMP) peuvent être inhibés localement au cours de l'induction de la crête neurale dérivé os 4, 15, ou dans le membre en développement 13 bourgeon. Après une bille est implantée, l'embryon peut être replacée dans l'incubateur et continuera à se développer. Cela permet aux chercheurs de visualiser les effets en aval de l'inhibition d'un gène particulier (dans ce cas BMP), tels que l'inhibition de la formation de osselet scléral dans l'anneau sclérotique (figure 2B et 2C) 15. De même, les barrières peuvent être facilement insérés entre les couches de tissu, pour étudier la signalisation tissu à tissu et la micro-injection de colorants peut aussi facilement être effectué. 
Figure 1. Voir l'embryon ex ovo. (A) de la scène HH 20 embryon de poulet après l'enlèvement de la coquille, la flèche pointe vers l'embryon avec des membranes embryonnaires vascularisées. (B) de la scène A HH 40 des embryons dans une chambre d'humidité ouverte. (C) HH stade 35 embryonnaire montrant les bourgeons de membres début (flèche). (D) Stade HH 41 embryon montrant le développement de stade ultérieur de structures telles que l'œil (flèche). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Exemple de Noggin trempé perle Implantation EXPERIMent 4. (A) Embryon HH étape 35 exposée à travers un petit trou déchiré dans les membranes recouvrant afin d'accéder à l'œil sous-jacente de perles implantation. Fort grossissement du bourrelet d'Affigel adjacente à une papille conjonctivale est représenté sur encart. La barre d'échelle dans C est de 75 um. (B) phosphatase alcaline taché œil droit après Noggin cordon implantation (flèche) montrant écart dans l'anneau des osselets, HH 38 (C) AP teinté œil gauche montrant aucune perturbation à l'anneau de osselets (contrôle ), HH 38. Détails de cette expérience sont fournis dans Duench et Franz-Odendaal 4. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ex ovo culture et de fenêtrage à la fois des avantages et des défis. Ici, nous comparons les avantages et les défis de la tasse de styromousse ex ovo et la méthode de fenêtrage à notre ex optimisé ovo méthode présentée ici. Notre méthode permet la manipulation et l'observation aisée de l'embryon de poulet aux derniers stades de développement et nos améliorations à l'ex ovo traditionnelle méthode 1, 2, 3 en font en outre très facile à utiliser dans les classes de laboratoire d'enseignement de premier cycle.
Bien que de nombreux chercheurs préfèrent la méthode de fenêtrage pour étudier le développement de poulet, car il est simple à réaliser et a une excellente capacité de survie au stade avancé de développement (HH 41-42), il a ses limites. La plus importante est la capacité limitée pour voir l'embryon entier après l'étape 30. Après l'étape HH HH 30, la fenêtre dans la coquille doit être très grande pour afficher la, l'embryon se déplaçant de plus en plus. Cette grande fenêtre est diffcile pour sceller complètement (conduisant à des problèmes avec la stérilité et de survie), et l'obtention d'un bon éclairage intérieur de l'œuf peut être difficile. En outre, des embryons à un stade avancé sont grandes et difficiles d'accès (ou manipuler) à travers la fenêtre.
L'ex ovo méthode décrite ici fournit un accès complet sans restriction à l'embryon. Une fois que la bateau peser est placé dans la chambre d'humidité, l'ensemble du set-up est très stable. La chambre de l'ensemble de l'humidité peut être placé sous un microscope à dissection et grossissement élevé peut être utilisé pour observer la totalité de l'embryon. En comparaison, la méthode de tasse en polystyrène a une chambre d'humidité qui est grand (hauteur de coupe), ce qui rend très difficile de placer sous les objectifs de microscope. La conception de coupe est aussi beaucoup moins stable que le plat bateau et peser ces tasses peut facilement être renversé. Nos améliorations à la méthode ex ovo font de cette méthode simple à utiliser dans une salle de classe ou en laboratoire et permet la student d'avoir pleinement accès aux embryons des étapes HH 19 jusqu'à 40 HH; stades, lorsque l'organogenèse majeure se produit. Le plus grand inconvénient de notre ex ovo méthode est la stérilité. Afin de prévenir l'infection, notre procédé comprend l'addition d'antibiotiques. Une autre dose d'antibiotique peut être administré à l'embryon à un stade ultérieur. Les antibiotiques administrés pendant la culture mise en place ne semblent pas non plus affecter le développement de l'embryon. Stériliser des récipients avec 70% d'éthanol avant utilisation peut considérablement augmenter la capacité de survie.
Dans l'ensemble, l'ex ovo méthode est idéale pour la visualisation et la manipulation des embryons sans limitations concernant l'accès ou le stade de développement. Des recherches antérieures ont montré que la culture des embryons ex ovo ne affecte pas négativement motif 4,15. Par exemple, nous ne voyons pas de changements dans la structuration ou l'induction du squelette malgré l'absence de la coquille. Notre méthode améliorée résout multiples cDÉFIS qui existent avec l'ex traditionnelle actuelle ovo méthode 1,2, 3.
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Disclosures
Les auteurs ne ont aucun intérêts financiers concurrents en ce qui concerne l'information présentée dans ce manuscrit.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Paul Poirier, le producteur de médias, à l'Université Mount Saint Vincent pour son travail dans le tournage et l'édition de la partie vidéo de ce manuscrit. Nous reconnaissons en sciences naturelles et en génie du Canada pour le financement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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