Protocol
नोट: सभी आपूर्ति 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं।
1. चिकन भ्रूण भंडारण
- लगभग 40% नमी के साथ Gallus 37 ओ सी पर क्षैतिज Gallus तनाव का चिकन अंडे सेते हैं और एक या दो बार दैनिक अंडे की बारी है। अंडे की ओर मुड़ते eggshell का पालन करने से भ्रूण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
- 4 ओ सी पर अंडे रखने के लिए, पूर्व अन्यथा भ्रूण की जर्दी बड़े पैमाने पर करने के लिए उदर स्थित हो जाएगा और इसके अलावा चरण 3 में अंडा खोलने पर क्षतिग्रस्त हो जाएगा के रूप में संस्कृति की स्थापना के लिए 24 घंटे में अंडा बारी करने के लिए मत करो "पड़ाव" विकास के लिए ऊष्मायन से पहले कोई और अधिक से अधिक एक सप्ताह के लिए डिग्री, लेकिन यह आदर्श नहीं है।
2. चिकन भ्रूण मचान
- हैम्बर्गर और हैमिल्टन 12 मचान तालिका का उपयोग चिकन भ्रूण मंच। पूर्व ओवो संवर्धन की स्थापना के लिए आदर्श मंच एचएच चरण 19-20 (ऊष्मायन के 3 के आसपास दिन) BEC हैause इस सिर 53 HPF में बदल जाता है के बाद शीघ्र ही है।
नोट: एचएच चरण 19-20 निम्नलिखित रूपात्मक लक्षण की विशेषता है: somites पूंछ के बहुमत में बढ़ा रहे हैं, हालांकि पूंछ के अंत पूंछ कली curled है, अनुभाग-रहित रहता है, अपरापोषिका छोटा है और vasculature सीमित है, लेग कलियों विंग-कलियों से बड़े होते हैं और आंखों unpigmented कर रहे हैं या एक भूरा रंग है।
3. शैल से भ्रूण निकाला जा रहा है
- खोल से भ्रूण निकालने से पहले, 70% इथेनॉल के साथ खोल स्प्रे और यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं। इस भ्रूण को नुकसान होगा के रूप में तेजी से अंडे की बारी मत करो।
- सावधान होने के नाते ध्यान से कम पक्ष पर अंडे दरार, अंडे के उन्मुखीकरण को बदलने के लिए नहीं है (यानी, ऊष्मायन के दौरान उदर था कि पक्ष) और एक बाँझ में भ्रूण जारी नाव (88 X 88 X 23 मिमी) वजन। नीचे पोंछ 70% इथेनॉल के साथ नाव तौलना। जर्दी बोरी क्षतिग्रस्त नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण का निरीक्षण किया। जर्दी एच हैंटूट के रूप में यह नहीं बच जाएगा, के रूप में, भ्रूण त्यागें।
- यह व्यवहार्य है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण का निरीक्षण करें; दिल धड़क रहा है, vasculature के सामान्य दिखाई देता है, और कोई स्पष्ट असामान्यताएं मौजूद हैं। तौलना नाव के किनारों से सूख रहे हैं कि सुनिश्चित करें।
- एक विंदुक का प्रयोग, संक्रमण को रोकने में मदद करने के लिए एल्बुमिन के शीर्ष पर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 40 μl (5,000 इकाइयों पेनिसिलिन, मिलीलीटर प्रति 5 मिलीग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन) ड्रॉप।
4. आर्द्रता चैम्बर की तैयारी
- किम-पोंछे और / या एक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर (12 x 12 x 6 सेमी) के तल में कपास से बना एक शोषक पैड के एक छोटे से हो चुकी है, जगह 70% इथेनॉल के साथ मिटा दिया है।
- किम-पोंछे और / या कपास (पानी की लगभग 150 मिलीलीटर) को गीला करने बाँझ, आसुत जल जोड़ें।
5. पूर्व ओवो संस्कृति कोडांतरण
- नम गद्दी के शीर्ष पर भ्रूण युक्त तौलना नाव रखें। फिर, टी के शीर्ष पर एक वर्ग बाँझ पेट्री डिश (9.5 एक्स 9.5 सेमी) की जगह आधावह एक ढीला ढक्कन फार्म करने के लिए नाव का वजन।
- इसकी ढक्कन के साथ प्लास्टिक कंटेनर कवर। अभी भी कक्ष के अंदर अच्छा airflow के लिए अनुमति देता है कि एक आंशिक मुहर सुनिश्चित करने, ढक्कन के दो कोनों नीचे दबाएँ।
- ध्यान से वांछित स्तर तक 37 ओ सी इनक्यूबेटर में सेटअप जगह है।
- एक नियंत्रित आर्द्रता इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है, नमी नियंत्रित करने में मदद करने के लिए इनक्यूबेटर में पानी के कंटेनर में रखें। आर्द्रता कक्षों में और इनक्यूबेटर में सब पानी जीवाणुरहित और ऊष्मायन अवधि के दौरान जरूरत के रूप में फिर से भरना। 40% आर्द्रता आदर्श है।
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Representative Results
विधि ओवो इस पूर्व देर के विकास के चरणों (एच एच 40-41) (चित्रा 1 ए और 1 बी) के लिए विकास की प्रारंभिक अवस्था (एच एच 19/20) से भ्रूण के अवलोकन के लिए अनुमति देता है। एचएच 19-20 में संस्कृति की स्थापना संस्कृति में भ्रूण के survivability बढ़ जाती है। जीवित रहने संस्कृति में और चरण 21 के बाद बहुत कम है (53 HPF पहले) मोड़ सिर से पहले, भ्रूण कम बरकरार भ्रूण प्राप्त कर रहे हैं ताकि हटाने पर खोल लिए और अधिक छड़ी करने के लिए जाता है। (लगभग 40% एचएच 40-41 के लिए जीवित रहने के) सामान्य में, संस्कृति ओवो पूर्व में भ्रूण के survivability एचएच 35-36 (90-100%) अप करने के लिए अधिक है, लेकिन यह विकास के अधिक उन्नत चरणों में ड्रॉप करता है। यह है कि विकास के लिए दिखाया गया है, हालांकि इसके अतिरिक्त, इन देर चरणों में सामान्य प्रतीत होता है और कंकाल की patterning 4,15 अप्रभावित है, हम अंगों हड्डी बन जाना की डिग्री या समय प्रभावित हो सकता है, सुझाव है कि इन देर चरणों में तुले हैं कि मनाया है। इसी का नाम हेआश्चर्य की बात नहीं हड्डी बन जाना के लिए खोल से कैल्शियम के लिए की जरूरत पर विचार। नियंत्रण की तुलना में भ्रूण के विकास की एक विस्तृत तुलना चल रहा है और इस तरीके से कागज के दायरे से परे है।
विकास के दौरान भ्रूण के लिए पहुँच प्राप्त करने के दो मुख्य कारणों के लिए महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, शोधकर्ताओं खोलना और एक खिड़की reseal करने के लिए बिना एक दैनिक आधार पर विकास को देखने के लिए सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, व्यक्तियों कई चरणों (चित्रा 1C और 1D) में अंग और आंख के विकास का निरीक्षण करने में सक्षम हैं। दूसरे, संवर्धन ओवो पूर्व, भ्रूण के लिए अधिक से अधिक (अप्रतिबंधित) का उपयोग सक्षम बनाता है, जिससे आसान जोड़तोड़ या सर्जरी सक्षम करने से।
भ्रूण जोड़तोड़ सबसे अधिक बार, एक stereomicroscope का उपयोग किया जाना चाहिए। स्टायरोफोम / प्लास्टिक की चादर विधि 6,7,8 के लिए विरोध के रूप में यहाँ वर्णित संवर्धन विधि ओवो पूर्व का उपयोग कर सेट-अप आसानी से अंड रखा गया है भ्रूणएर माइक्रोस्कोप, कम गहरा है और नोक पर नहीं होगा। भ्रूण obscuring कोई अवरोध (अंडे के खोल) के बाद से वहाँ और चैम्बर बहुत ही स्थिर है, क्योंकि यह जरूरत है और भ्रूण के लिए उपयोग का अनुकूलन करने के लिए इसे बारी बारी से करने के रूप में ठीक आर्द्रता चैम्बर की स्थिति के लिए शोधकर्ता सक्षम बनाता है। कुल मिलाकर, भ्रूण तौलना नाव से प्राप्त समर्थन कोमल दबाव सेट अप गिराए जाने के बिना हेरफेर के दौरान भ्रूण के लिए लागू किया जा करने के लिए अनुमति देता है।
कई विकासात्मक जीव विज्ञान के तरीकों इस संस्कृति प्रणाली में भ्रूण पर आयोजित किया जा सकता है। इन विस्तृत अंग की टिप्पणियों (जैसे, आंख, मस्तिष्क आदि) या टेराटोजेनिक एजेंटों के ऊतक विकास (जैसे, रक्त वाहिनियों की वृद्धि) या आवेदन शामिल हैं। जोड़तोड़ अलग ऊतक परतों के संयोजन या ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस 14 का अध्ययन कर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए chorioallantoic झिल्ली पर ऊतकों की कलम बांधने का काम शामिल है। विकास के दौरान प्रदर्शन एक अन्य लोकप्रिय हेरफेर BEA हैडी या बाधा आरोपण। मनका आरोपण एक शोधकर्ता को बाधित या हित के क्षेत्र में स्थानीय स्तर पर जीनों प्रेरित करने के लिए स्थानीय स्तर पर मनका मनका पर एक अवरोध करनेवाला या कारक लेना और फिर प्रत्यारोपण के लिए अनुमति देता है। इस बार affigel या हेपरिन मोती (2A चित्रा) का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, हड्डी morphogenetic प्रोटीन (BMPs) स्थानीय स्तर पर हड्डी 4, 15 व्युत्पन्न तंत्रिका शिखा की प्रेरण के दौरान हिचकते किया जा सकता है, या विकासशील अंग में 13 बड। एक मनका प्रत्यारोपित किया जाता है के बाद, भ्रूण इनक्यूबेटर लौटा जा सकता है और इसे विकसित करने के लिए जारी रहेगा। यह शोधकर्ताओं ऐसे श्वेतपटली रिंग में स्क्लेरल हड्डी गठन के निषेध (चित्रा 2B और 2C) के रूप में 15, (इस मामले बीएमपी) में एक विशेष जीन के निषेध के बहाव के प्रभाव को देखने के लिए अनुमति देता है। इसी प्रकार, बाधाओं को आसानी से ऊतक-टू-ऊतक संकेतन और रंगों के microinjection भी आसानी से आयोजित किया जा सकता का अध्ययन करने के क्रम में ऊतक परतों के बीच डाला जा सकता है। 
भ्रूण पूर्व ओवो देखने चित्रा 1। (ए) एचएच चरण खोल से हटाने के बाद 20 लड़की भ्रूण, vascularized भ्रूण झिल्ली के साथ भ्रूण के लिए तीर अंक। (बी) ए एच एच मंच एक खुला आर्द्रता चैम्बर में 40 भ्रूण। (सी) एचएच चरण जल्दी अंग कलियों (तीर) दिखा 35 भ्रूण। (डी) ऐसी आंख (तीर) के रूप में संरचनाओं के बाद के चरण के विकास दिखा स्टेज एचएच 41 भ्रूण। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नोगिन चित्रा 2. उदाहरण आरोपण experim मनका लथपथईएनटी 4। (ए) के भ्रूण एचएच चरण 35 मनका आरोपण के लिए अंतर्निहित आँख करने के लिए पहुँच प्राप्त करने के क्रम में overlying झिल्ली में फटे एक छोटा सा छेद के माध्यम से अवगत कराया। एक नेत्रश्लेष्मला अंकुरक से सटे affigel मनका के उच्च बढ़ाई इनसेट में दिखाया गया है। सी में स्केल बार 75 माइक्रोन है। (बी) alkaline फॉस्फेट औसिक्ल्स की अंगूठी में अंतर दिखा नोगिन मनका आरोपण (तीर), औसिक्ल्स की अंगूठी के लिए कोई व्यवधान दिखा एचएच 38 (सी) एपी दाग बाईं आंख (नियंत्रण के बाद दाहिनी आंख दाग ), इस प्रयोग के 38. विवरण Duench और फ्रांज-Odendaal 4 में प्रदान की जाती हैं एच एच। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
संवर्धन और दोनों windowing ओवो पूर्व फायदे और चुनौतियों का सामना किया। यहाँ हम फायदे और विधि ओवो स्टायरोफोम कप पूर्व और यहाँ दिखाया विधि ओवो हमारे अनुकूलित करने के लिए पूर्व गवाक्षन विधि की चुनौतियों की तुलना करें। हमारे विधि देर के विकास के चरणों और विधि 1, 2 ओवो पारंपरिक पूर्व के लिए हमारे शोधन में हेरफेर और लड़की भ्रूण की आसान अवलोकन सक्षम बनाता है, 3 स्नातक शिक्षण प्रयोगशाला कक्षाओं में उपयोग करने के लिए यह अतिरिक्त बहुत आसान बनाते हैं।
यह प्रदर्शन करने के लिए सरल है और विकास की देर चरणों (एच एच 41-42) के लिए उत्कृष्ट जीवित रहने की है, क्योंकि कई शोधकर्ताओं चिकन विकास का अध्ययन करने के लिए गवाक्षन तरीका पसंद है, यह सीमाएँ हैं। जिसमें से सबसे बड़ा मंच बाद एचएच 30 एचएच चरण 30 के बाद पूरे भ्रूण देखने के लिए सीमित क्षमता है, खोल में खिड़की से बढ़ रही है, चलती भ्रूण देखने के क्रम में बहुत बड़े होने की जरूरत है। इस बड़ी खिड़की अन्तर हैicult पूरी तरह से (बाँझपन और survivability के साथ समस्याओं के लिए अग्रणी), और चुनौतीपूर्ण हो सकता है अंडे के अंदर अच्छा प्रकाश प्राप्त सील करने के लिए। इसके अलावा, उन्नत चरण भ्रूण खिड़की के माध्यम से बड़े और मुश्किल का उपयोग करने के लिए (या हेरफेर) कर रहे हैं।
यहाँ वर्णित विधि ओवो पूर्व भ्रूण के लिए पूर्ण बेहिचक पहुँच प्रदान करता है। तौलना नाव नमी कक्ष में रखा गया है, एक बार पूरे सेट अप बहुत स्थिर है। पूरे आर्द्रता चैम्बर एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रखा जा सकता है और उच्च बढ़ाई पूरे भ्रूण निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसकी तुलना में, स्टायरोफोम कप विधि लंबा है कि एक आर्द्रता चैम्बर (कप ऊंचाई) है और यह बहुत मुश्किल माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के तहत जगह बनाता है। कप डिजाइन नाव का वजन भी कम अभी तक स्थिर फ्लैट से है और इन कप आसानी से खत्म खटखटाया जा सकता है। विधि ओवो पूर्व के लिए हमारे सुधार एक कक्षा या प्रयोगशाला स्थापित करने में उपयोग करने के लिए इस विधि का सीधा बनाने के लिए और सेंट में सक्षम बनाता हैएचएच 40 के माध्यम से मंच एचएच 19 से भ्रूण के लिए पूरा उपयोग किया है udent; प्रमुख जीवोत्पत्ति उत्पन्न हो रही है जब चरणों। विधि ओवो हमारे पूर्व का सबसे बड़ा नुकसान बाँझपन है। संक्रमण को रोकने के क्रम में, हमारे विधि एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा भी शामिल है। एंटीबायोटिक की एक और खुराक बाद के चरणों में भ्रूण के लिए दिया जा सकता है। संस्कृति सेट-अप के दौरान प्रशासित एंटीबायोटिक दवाओं भी भ्रूण के विकास को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है। नाटकीय रूप से जीवित रहने को बढ़ा सकते हैं का उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ कंटेनर स्टरलाइज़।
कुल मिलाकर, विधि ओवो पूर्व विकास के उपयोग या मंच पर सीमाओं के बिना भ्रूण को देखने और जोड़ तोड़ के लिए आदर्श है। पिछले अनुसंधान भ्रूण पूर्व ओवो संवर्धन नकारात्मक 4,15 patterning को प्रभावित नहीं करता है कि दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, हम eggshell के अभाव के बावजूद patterning या कंकाल की प्रेरण में कोई परिवर्तन नहीं दिख रहा है। सुधार और हमारे विधि एकाधिक सी हल करती हैविधि 1,2, 3 ओवो मौजूदा पारंपरिक पूर्व के साथ मौजूद है कि hallenges।
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Disclosures
लेखक इस पांडुलिपि में प्रस्तुत जानकारी के संबंध में कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।
Acknowledgments
हम उसका फिल्मांकन में काम करते हैं और इस पांडुलिपि के वीडियो भाग संपादन के लिए माउंट सेंट विंसेंट विश्वविद्यालय में पॉल Poirier, मीडिया निर्माता, धन्यवाद देना चाहूंगा। हम धन के लिए कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
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