Protocol
注：すべての物資を表1に記載されています。
1.鶏胚の保存
- ガルスは約40％の湿度で37°Cので水平ガルスと1日1回または2回卵を回し株の鶏の卵をインキュベートする。卵を回すと、卵殻に付着するの胚を防止することが重要である。
- 4 O Cで卵を保つ、前にそうでない胚は卵黄塊に腹側に位置され、さらにステップ3で卵を開くに破損しますように文化のセットアップに24時間で卵をオンにしないでください「停止」開発へのインキュベーション前せいぜい1週間程度が、これは理想的ではありません。
2.鶏胚をステージング
- ハンバーガーとハミルトン12ステージング表を使用して、ニワトリ胚を上演。 EX-OVO培養をセットアップするための理想的なステージは、HHステージ19-20（インキュベーションの3日前後）BECですこのause頭が53 HPFで回転直後にある。
注：HHステージ19-20は、以下の形態学的特徴によって特徴付けられる：体節の尾の大部分に拡張され、しかし尾の最後尾芽がカールされ、セグメント化されていないまま、尿膜が小さく、脈管構造を制限して、脚芽は翼の芽より大きく、目は無着色であるか、または灰色がかった色合いを持っている。
3.シェルから胚を削除する
- シェルから胚を削除する前に、70％エタノールでシェルをスプレーし、乾燥させます。これは胚を損傷するように急速に卵を入れないでください。
- 、卵の向きを変える慎重に下側に卵を割る（すなわち、インキュベーション中に腹だった側）と、滅菌に胚を解放しないように注意してくださいということは、ボート（88 X 88 X 23 mm）を量る。ダウンワイプ70％エタノールでボートを量る。卵黄袋が破損していないことを確認するために胚を点検。卵黄hの場合、破損それは生存しないであろうように、胚を破棄。
- それが実行可能であることを保証するために胚を観察。心臓が鼓動している、血管系が正常に表示され、明らかな異常は存在しない。量るボートのエッジが乾燥していることを確認してください。
- ピペットを用いて、感染を防ぐためにアルブミンの上にペニシリン/ストレプトマイシンを40μl（5000単位のペニシリン、1mlあたり5 mgのストレプトマイシン）をドロップします。
4.湿度商工会議所の準備
- キム·ワイプおよび/または無菌のプラスチック容器（12×12×6センチ）の底に綿で作られた吸収パッドの小さな積み重ねを置き、70％エタノールで拭い。
- キム·ワイプおよび/または綿（水約150ミリリットル）を湿らせるために、滅菌蒸留水を追加します。
5.例OVO文化の組み立て
- 湿ったパディングの上に胚を含む量るボートを置きます。その後、Tの上に正方形の無菌のペトリ皿（9.5 X 9.5センチメートル）の代わりの半分彼は緩い蓋を形成するためにボートを量る。
- その蓋付きのプラスチック容器をカバーしています。まだチャンバ内の良い空気の流れを可能にし、部分的なシール性を確保する、蓋の2コーナーを押し下げます。
- 慎重に所望の段階まで37 O C のインキュベーターにセットアップを置く。
- 制御された湿度のインキュベーターが使用できない場合、湿度を制御するのを助けるために培養器内の水の容器を置きます。湿度チャンバー内で、インキュベーター内のすべての水を殺菌し、インキュベーション期間中に必要に応じて補充する。 40％の湿度が理想的です。
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Representative Results
方法OVOこれexは （ 図1Aおよび1B）開発の後期段階（HH 40-41）、開発の初期段階（HH 19/20）からの胚を観察することができます。 HH 19-20で培養物を設定するには、培養液中の胚の生存性を向上させます。生存性、培養中、ステージ21の後に非常に低い（53 HPF前）を回し頭に先立ち、胚が少なく、完全な胚が得られるように、取り外す上のシェルにより固執する傾向がある。一般的には、文化OVO EXにおける胚の生存性は高いHH 35-36（百分の90から100）までですが、それは（約40％がHH 40-41に生き残る）開発のより進行した段階で低下します。その開発は、これらの後期の段階で正常表示され、骨格のパターニング4,15影響を受けないことが示されているが、さらに、我々は、四肢骨化の度合いやタイミングが影響を受ける可能性があることを示唆しているこれらの後期段階で折り曲げられていることを観察した。これは驚くべきことではない骨化のためのシェルからのカルシウムの必要性を検討。対照と比較して、胚の開発の詳細な比較が進行中であり、このメソッドの論文の範囲を超えている。
開発を通して胚へのアクセスを取得する2つの主な理由のために重要である。まず、研究者は、窓を開封及び再封することなく、日常的に開発を表示することができる。例えば、個人が複数のステージ（ 図1Cおよび1D）で四肢と眼の発達を観察することができます。第二には、培養OVO EXは 、胚へのより大きな（無制限）アクセスを可能にし、それによってより簡単な操作、または手術を可能にする。
胚の操作は、ほとんどの場合、実体顕微鏡を使用して実行される必要がある。発泡スチロール/プラスチックラップ方法6,7,8とは対照的に、ここで説明する培養方法OVO EXを使用して、セットアップが簡単にウント置かれる胚ER顕微鏡は、少なく深く、転倒しません。胚を曖昧に何の障害（卵の殻）が存在しないため、チャンバは、非常に安定しているので、これは、必要に応じて、胚へのアクセスを最適化するためにそれを回転させるように正確に湿度チャンバを配置するために研究を可能にする。全体的に、胚は量るボートから受けるサポートは穏やかな圧力は、セットアップ転倒せずに操作中の胚に適用することができます。
いくつかの発生生物学の方法は、この培養系における胚に行うことができる。これらは、詳細な臓器の観察（ 例えば、眼、脳など）または組織の発達（ 例えば、血管増殖）または催奇形物質の適用を含む。操作は、異なる組織層を結合するか、腫瘍増殖および転移14を研究の効果を研究するための漿尿膜上の組織の移植を含む。開発中に実施もう一つの人気の操作は、BEAですDまたはバリア移植。ビーズ注入は、研究者が、ビーズ上に阻害剤または因子を浸した後、関心のある領域で局所的に遺伝子を阻害または誘導するために、ローカルにビーズを移植することができます。これは、多くの場合、アフィゲルまたはヘパリンビーズ（ 図2A）を使用して行われる。例えば、骨形態形成タンパク質（BMP）は、局所的に骨4,15由来神経堤の誘導の間に抑制することができ、または現像肢13に出芽する。ビーズが注入された後、胚をインキュベーターに戻すことができ、それが発展し続ける。これは、研究者はそのような硬化性リング（ 図2Bおよび2C）15で強膜小骨形成の阻害など特定の遺伝子（この場合はBMP）の阻害の下流効果を、表示することができます。同様に、容易に組織対組織シグナリングおよび染料のマイクロインジェクションを研究するために、組織層の間に挿入することができる障壁も容易に行うことができる。 
図1.胚のEX OVOの表示。シェルから除去した後の（A）HHステージ20ニワトリ胚、血管化胚性膜と胚への矢印ポイントを。（B）HHステージ40胚をオープン湿度室で。（C）初期の肢芽を示すHHステージ35胚（矢印）。そのような目（矢印）のような構造の後の段階の開発を示す（D）ステージHH 41胚。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ノギン浸したビーズ移植Experim図2.例ENT 4（A）胚HHステージ35は、ビーズ移植のための基礎となる目へのアクセスを得るために、上に重なる膜に引き裂かれた小さな穴を介して露出。結膜乳頭に隣接フィゲルビーズの高倍率の差し込み図に示されている。 C 75程度である。（B）アルカリホスファターゼ中のスケールバーは、ノギンビーズ注入（矢印）小骨のリングへの混乱を示さない小骨のリングにギャップを示す、HH 38（C）AP染色左目（制御後の右目を染色）、この実験のHH 38.詳細はDuenchとフランツ·Odendaal 4に設けられている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
利点と課題を持っているの両方を培養し、ウィンドウイングOVO例 。ここでは、メソッドOVO発泡スチロールのカップEXとここに示した方法OVO私たちの最適化された元のウィンドウ操作方法の利点と課題を比較する。我々の方法は、学部教授の研究室のクラスで使用することがさらに非常に簡単に作る方法1、2、3、OVO伝統EXに操作と開発の後期段階にあるニワトリ胚の容易な観察 と私たちの改良を可能にします。
それが実行するのが簡単で、開発の後期段階（HH 41-42）に優れた生存性を持っているので、多くの研究者が鶏の開発を研究するためのウィンドウメソッドを好むが、それには限界がある。ステージHH 30の後のHHステージ30の後に全体の胚を表示する能力が限られとなっている最大のものは、卵殻の窓は、胚を移動し、成長を表示するために非常に大きくする必要がある。この大きなウィンドウは差分ですicult完全に（無菌性および生存性に問題につながる）にシールする、と卵の内側に良い照明を得ることが困難な場合があります。また、進行した段階の胚は、窓からのアクセス（または操作）するために大きく困難である。
ここで説明する方法OVO EXは、胚への完全な奔放のアクセスを提供します。計量ボート湿度チャンバ内に配置されると、全体のセットアップは非常に安定である。全体湿度室は、解剖顕微鏡下に配置することができ、高倍率全体胚を観察するために使用することができる。比較では、発泡スチロールのカップ法は、背の高い湿度室（カップ高さ）を有し、このことは非常に困難な顕微鏡対物レンズの下に配置することができる。カップのデザインは、ボートの重さもはるかに少ない安定したフラットよりであり、これらのカップは、簡単に上のノックアウトすることができます。方法OVO EXへの私達の改善は、教室や研究室の設定で使用するには、この方法は簡単にし、STが可能になりHH 40に至るまでの段階HH 19からの胚へのフルアクセスを持っているudent。主要な器官が発生している段階。方法OVO私たちの元の最大の欠点は、無菌性である。感染を防ぐために、我々の方法は、抗生物質の添加を含む。抗生物質の別の投与量は、後の段階で胚に与えることができる。培養セットアップ中に投与した抗生物質はまた、胚の発育に影響を与えるように表示されません。劇的に生存性を向上させることができ、使用前に70％エタノールを有する容器を殺菌する。
全体的に、この方法OVO exは 、開発のアクセスやステージ上の制限なしに胚を表示し、操作するための理想的です。これまでの研究では、胚のEX OVOを培養すると、マイナスに4,15をパターニングすることは影響しないことが示されている。例えば、私たちは卵殻の不在にもかかわらず、骨格のパターニングや誘導の変更が表示されません。私たちの改良された方法は、複数のCを解決します方法1,2、3 OVO現在の伝統的なEXで存在するhallenges。
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Disclosures
著者は、この原稿に記載されている情報に関してには競合する経済的利益を持っていない。
Acknowledgments
我々は彼の撮影中の作業と、この原稿のビデオ部分を編集するためのマウントセントビンセント大学のポール·ポワリエ、メディアプロデューサーを、感謝したいと思います。当社は、資金調達のためにカナダの自然科学工学研究評議会を承認。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
