Protocol
הערה: כל הציוד מפורטים בטבלה 1.
1. אחסון עוברי העופות
- דגירה ביצי תרנגולת של זן גאלוס גאלוס אופקי על 37 מעלות צלסיוס ולחות כ -40% ולהפוך ביצי פעם או פעמיים ביום. הפיכת ביצים היא חשובה כדי למנוע את העובר מהקפדה על קליפת הביצה.
- לא להפוך את הביצה בשעה 24 לפני הקמת התרבות אחרת העובר יהיה ממוקם הגחון למסת החלמון ויהיה פגום על פתיחת הביצה בשלב 3. בנוסף, לשמור על הביצים ב 4 o C מעלות ללא יותר משבוע אחד לפני הדגירה לפיתוח "עצירה" אבל זה לא אידיאלי.
2. Staging עוברי עופות
- לביים את עוברי העוף באמצעות המבורגר ושולחן בימוי המילטון 12. השלב האידיאלי להקמת culturing לשעבר אובו הוא HH שלב 19-20 (כ 3 ימים של דגירה) BECause זה זמן קצר לאחר שהראש מסתובב על 53 hpf.
הערה: שלב HH 19-20 מתאפיין בתכונות המורפולוגיות הבאות: somites מורחבים למרבית הזנב, אך סופו של הזנב נשאר unsegmented, ניצן הזנב מסולסל, allantois הוא קטן וכלי דם מוגבל, הרגל-הניצנים הם גדולים יותר מאשר באגף-ניצנים והעיניים הן חסרות צבע או שיש לו גוון אפרפר.
3. הסרת העובר מShell
- לפני הסרת העובר מהפגז, לרסס את הפגז עם אתנול 70% ולאפשר לו להתייבש. אל תכבה את הביצה במהירות כמו זה יגרום ניזק לעובר.
- נזהר שלא לשנות את הכיוון של הביצה, לפצח בזהירות את הביצה בצד התחתון (כלומר, הצד שהיה הגחון במהלך דגירה) ולשחרר את העובר לסטרילי לשקול סירה (88 x 88 x 23 מ"מ). נגב את לשקול סירות עם אתנול 70%. בדוק את העובר על מנת להבטיח כי שק החלמון אינו פגום. אם h החלמוןכשבור, לבטל את העובר, כפי שהוא לא ישרוד.
- שים לב לעובר, כדי להבטיח שזה בר-קיימא; הלב פועם, כלי דם מופיע נורמלים, ואין חריגות ברורות נוכחים. ודא שהקצוות של הסירה לשקול יבשים.
- בעזרת פיפטה, ירידה של 40 μl של פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין 5,000 יחידות, 5 סטרפטומיצין מ"ג למ"ל) על גבי אלבומין כדי למנוע זיהום.
4. הכנת תא לחות
- הנח ערמה קטנה של kim-מגבונים ו / או כרית סופגת עשויה כותנה בחלק התחתון של מיכל פלסטיק סטרילי (12 x 12 x 6 סנטימטרים) ניגב עם אתנול 70%.
- מוסיף מים סטריליים, מזוקקים כדי ללחלח את kim-המגבונים ו / או כותנה (כ -150 מיליליטר מים).
5. הרכבת Ex אוב התרבות
- הנח את הסירה לשקול מכילה את העובר על גבי הריפוד הלח. לאחר מכן, מחצית מקום של צלחת פטרי רבועה סטרילי (9.5 x 9.5 סנטימטר) על גבי tהוא שוקל סירה כדי ליצור מכסה רופף.
- מכסה את מיכל הפלסטיק עם המכסה שלה. לחץ כלפי מטה שתי פינות של המכסה, להבטיח חותם חלקי שעדיין מאפשר לזרימת אוויר טוב בתוך החדר.
- זהירות במקום ההתקנה לתוך חממת C 37 o עד שלב רצוי.
- הנח מכולות של מים בחממה כדי לעזור לשלוט בלחות, אם חממת לחות מבוקרת אינה זמינה. לעקר את כל המים בתאי לחות ובחממה ולחדש במידת הצורך במהלך תקופת הדגירה. לחות 40% היא אידיאלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לשעבר זה אוב השיטה מאפשר התצפית של עוברים משלבים המוקדמים של פיתוח (HH 19/20) לשלבים המאוחרים של התפתחות (HH 40-41) (איור 1 א ו -1 B). הגדרת התרבות בHH 19-20 מגדילה שרידות של העוברים בתרבות. לפני ראש הפיכה (לפני 53 hpf) שרידות נמוכות מאוד בתרבות ובאחרי שלב 21, העובר נוטה להיצמד יותר למעטפת בהסרה כל כך עוברים שלמים פחות מתקבלים. באופן כללי, שרידות של העובר באובו לשעבר התרבות היא גבוהות עד HH 35-36 (90-100%), אך היא עושה טיפה בשלבים המתקדמים יותר של פיתוח (כ -40% לשרוד לHH 40-41). בנוסף, למרות שזה הוכח פיתוח שמופיע נורמלי בשלבים המאוחרים והדפוסים של השלד אינם מושפע 4,15, שראינו כי הגפיים כפופים בשלבים מאוחר אלה מצביעים על כך שהתואר או העיתוי של התאבנות עשוי להיות מושפע. זהלא מפתיע בהתחשב בצורך בסידן מהקליפה להתאבנות. השוואה מפורטת של התפתחות העובר השוואה לקבוצת ביקורת נמצאת בעיצומו ומעבר להיקף של נייר שיטות זה.
קבלת גישה לעובר במהלך ההתפתחות חשובה משתי סיבות עיקריות. ראשית, חוקרים יכולים להציג פיתוח על בסיס יומי מבלי לפרוץ דרך ולאטום חלון. לדוגמא, אנשים יכולים להתבונן בגוף ובפיתוח עין בשלבים מרובים (איור 1 ג ו1D). שנית, לשעבר אוב culturing מאפשר גישה רבה יותר (חופשית) לעובר, ובכך מאפשר מניפולציות או ניתוחים קלים יותר.
מניפולציות עובריים לרוב, צריכה להתבצע באמצעות סטראו. באמצעות לשעבר אוב שיטת culturing המתואר כאן, בניגוד לשיטה / הניילון הנצמד קלקר 6,7,8 עובר ההגדרה ממוקמת בקלות undאה מיקרוסקופ, הוא פחות עמוק ולא להתהפך. זה מאפשר לחוקר כדי למקם את תא לחות בדיוק בהתאם לצורך וכדי לסובב אותו כדי לייעל את הגישה לעובר, שכן אין חסמים (קליפת ביצה) מסתירים את העובר ומאז הקאמרית הוא מאוד יציב. בסך הכל, תמיכת העובר מקבל מהסירה לשקול מאפשרת לחץ עדין שיחול על העובר במהלך מניפולציה ללא ההגדרה מתהפכת.
ניתן לבצע במספר שיטות ביולוגיה התפתחותית בעוברים במערכת זו התרבות. אלה כוללים תצפיות מפורטות של איבר (למשל, עין, וכו 'מוח) או פיתוח רקמות (למשל, צמיחת כלי דם) או יישום של סוכנים טרטוגניות. מניפולציות כוללות השתלה של רקמות על קרומי chorioallantoic כדי לחקור את ההשפעה של שילוב שכבות רקמה שונות או לומדים צמיחת גידול וגרור 14. עוד מניפולציה פופולרית שבוצעה במהלך הפיתוח היא beaהשתלת ד או מכשול. השתלת חרוז מאפשרת חוקר לספוג מעכב או גורם על חרוז ולאחר מכן להשתיל את חרוז באופן מקומי כדי לעכב או לגרום לגנים באופן מקומי באזור של עניין. זה לעתים קרובות נעשה שימוש בחרוזי affigel או הפרין (איור 2 א). לדוגמא, חלבוני עצם המוךפו"גנטי (BMPs) יכולים להיות מעוכבים באופן מקומי באינדוקציה של רכס עצבי נגזרה עצם 4, 15, או באיבר פיתוח ניצן 13. לאחר חרוז מושתל, העובר יכול להיות חזר לחממה והוא ימשיך להתפתח. הדבר מאפשר לחוקרים להציג את ההשפעות במורד הזרם של העיכוב של גן מסוים (במקרה זה BMP), כגון עיכוב של היווצרות ossicle scleral בטבעת הטרשתית (איור 2 ו2C) 15. באופן דומה, יכולות בקלות להיות מוכנסות מחיצות בין שכבות רקמה כדי ללמוד איתות רקמה לרקמה וmicroinjection של צבעים גם יכול בקלות להיות שנערך. 
איור 1. צפייה באובו לשעבר עובר. (א) שלב HH 20 עובר אפרוח לאחר הוצאתו מהפגז, נקודות חץ לעובר עם קרומים עובריים כלי דם. (ב) שלב HH 40 עובר בתא לחות פתוח. (C) שלב HH 35 עובר מראה ניצנים מוקדמים איבר (חץ). (ד) העובר שלב HH 41 מראים פיתוח שלב מאוחר יותר של מבנים כגון העין (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. דוגמא של Noggin ספוג חרוז ההשרשה Experimאף אוזן גרון 4. (א) העובר שלב HH 35 נחשף דרך חור קטן הקרוע בקרומים מעל כדי לקבל גישה לעין הבסיסית להשתלת חרוז. ההגדלה גבוהה של חרוז affigel הסמוך לpapilla הלחמית מוצגת בהבלעה. בר סולם בC הוא 75 מיקרומטר. (B) phosphatase אלקליין מוכתם עין ימין לאחר השתלת חרוז Noggin (חץ) מראה פער בטבעת של ossicles, מוכתם עין 38 AP (C) HH עזב מראה שום הפרעה לטבעת של ossicles (שליטה ), HH 38. פרטים של ניסוי זה ניתן בDuench ו -4 פרנץ-Odendaal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex אוב culturing וחלונאית לשניהם יש יתרונות ואתגרים. כאן אנו משווים את היתרונות והאתגרים של האקס קלקר כוס אוב השיטה ושיטת חלונאית לשעבר המותאם אוב השיטה שמוצגת כאן. השיטה שלנו מאפשרת מניפולציה והתבוננות קלה של עובר אפרוח בשלבים מאוחרים של התפתחות והחידודים שלנו לשעבר המסורתיים אוב השיטה 1, 2, 3 לעשות את זה גם מאוד קל לשימוש בשיעורי מעבדה הוראה לתואר ראשון.
למרות שחוקרים רבים מעדיפים את שיטת חלונאית ללמוד פיתוח עוף כי זה פשוט לבצע ויש לו שרידות מצוינות לשלבים מאוחרים של התפתחות (HH 41-42), יש לה מגבלות. הגדול שבם היא היכולת המוגבלת לצפייה בכל העובר אחרי שלב HH 30. לאחר שלב 30 HH, החלון בקליפת הביצה צריך להיות גדול מאוד על מנת להציג את העובר מתפתח, נע. חלון גדול זה הבדלicult לאטום לחלוטין (שמוביל לבעיות עם עקרות ושרידות), וקבלת תאורה טובה בתוך הביצה יכולה להיות מאתגר. בנוסף, עובר שלב מתקדם הם גדולים וקשים לגישה (או לתפעל) דרך החלון.
לשעבר אוב השיטה המתוארת כאן מספק גישה חסרת מעצורים מלאים לעובר. ברגע שהסירה לשקול ממוקמת בתא לחות, כל המכלול הוא מאוד יציב. תא לחות כל יכול להיות ממוקם תחת מיקרוסקופ לנתח והגדלה גבוהה יכולה לשמש כדי לבחון את כל העובר. לשם השוואה, יש שיטת כוס קלקר תא לחות שהוא גבוה (גובה כוס) וזה עושה את זה קשה מאוד למקום תחת מטרות מיקרוסקופ. עיצוב הכוס הוא גם הרבה פחות יציב משטוח לשקול סירה ובקלות ניתן הפילו הכוסות הללו. השיפורים שלנו לשעבר אוב השיטה להפוך שיטה זו פשוטה לשימוש בסביבה בכיתה או במעבדה ומאפשר student לקבל גישה מלאה לעוברים מהשלב HH 19 עד HH 40; שלבים כאשר organogenesis הגדול מתרחש. החסרון הגדול ביותר שלנו לשעבר אוב השיטה הוא עקרות. על מנת למנוע זיהום, השיטה שלנו כוללת תוספת של אנטיביוטיקה. מנה נוספת של אנטיביוטיקה יכולה להינתן לעובר בשלבים מאוחר יותר. האנטיביוטיקה הניתנת במהלך הגדרת התרבות גם אינה מופיעה כדי להשפיע על התפתחות העובר. חיטוי מיכל עם אתנול 70% לפני השימוש באופן דרמטי יכולה להגדיל את השרידות.
בסך הכל, לשעבר אוב השיטה אידיאלי לצפייה וטיפול בעוברים ללא מגבלות על גישה או שלב התפתחות. המחקרים קודמים הראו כי culturing עוברי אובו לשעבר אינו משפיע לרעה על דפוסי 4,15. לדוגמא, אנחנו לא רואים שום שינוי בדפוסים או האינדוקציה של השלד למרות היעדר קליפת הביצה. השיטה משופרת שלנו פותרת ג מרובהhallenges שקיימות עם האקס המסורתי הנוכחי אוב השיטה 1,2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אי לנו אינטרסים כלכליים מתחרים בכל הקשור למידע המוצג בכתב היד הזה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לפול Poirier, מפיק Media, בסיינט וינסנט אוניברסיטת הר לעבודתו בצילום ועריכת וידאו החלק של כתב היד הזה. אנו מכירים במדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה למימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
