Meten van In Vivo veranderingen in extracellulaire Neurotransmitters tijdens natuurlijk belonen van gedrag in vrouwelijke Syrische Hamsters

Summary

Deze paper gegevens het gebruik van vaste-potentieel amperometrische opnamen met behulp van koolstofvezel elektroden en de enzymatische biosensor technologie voor het meten van de vrijlating van dopamine en glutamaat met hoge temporele resolutie tijdens natuurlijke lonende gedrag in de vrouwelijke hamster.

Abstract

De mogelijkheid voor het meten van de neurotransmitter release op een snelle tijdschaal kunt patronen van transmissie moet worden gekoppeld aan specifieke gedrag of manipulaties; een krachtig instrument in het ophelderen van de onderliggende mechanismen en circuits. Terwijl de techniek van microdialysis al tientallen jaren gebruikt is voor het meten van vrijwel elke analyt van belang in de hersenen, wordt deze techniek beperkt in temporele resolutie. U kunt ook is snel aftasten cyclische voltammetrie zowel stoffelijk nauwkeurig en uiterst gevoelig; echter, omdat deze technisch moeilijke methode op de electroactivity van de analyt van belang berust, de mogelijkheid om nonelectroactive stoffen (b.v., de neurotransmitter glutamaat) te sporen wordt geëlimineerd. Dit document een overzicht van het gebruik van een turn-key systeem dat vaste-potentieel amperometry en enzymatische biosensing voor het meten van zowel electroactive als nonelectroactive neurotransmitters met temporele precisie combineert. De koppeling van deze twee krachtige technieken zorgt voor het meten van zowel tonic en phasic transmissie met relatief gemak, en vergunningen gelijktijdig opnemen van meerdere neurotransmitters. Het doel van dit manuscript is om aan te tonen het proces voor het meten van dopamine en glutamaat transmissie in vivo een natuurlijk belonen gedrag (dat wil zeggen, seksueel gedrag) gebruiken in vrouwelijke hamsters, met het uiteindelijke doel van het weergeven van de technische haalbaarheid van deze bepaling voor de behandeling van andere gedragingen en experimentele paradigma’s.

Introduction

De mogelijkheid voor het meten van de neurotransmitter release in wakker gedragend dieren kunt onderzoekers koppelen van specifieke gedragingen met ruimtelijke en temporele patronen van transmissie-een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken mechanismen en circuits onderliggende beide natuurlijke en operante gedrag in real-time. Historisch gezien is microdialysis werkzaam zijn voor het meten van zowel elektrisch reactieve en nonreactive stoffen in de extracellulaire omgeving van de hersenen-¹. Deze techniek maakt gebruik van een continue stroom van een waterige oplossing van soortgelijke Ionische samenstelling van de extracellulaire vloeistof, door middel van een microdialysis-sonde bestaat uit een kleine schacht met een topje gemaakt van een semipermeable holle vezel membraan². Na het inbrengen van de sonde, neurotransmitters of andere analyten van belang kunnen kruisen de semipermeable membraan door passieve diffusie voordat de tussenpozen voor latere analyse wordt verzameld door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC), een analytische chemie techniek vaak gebruikt om te scheiden, identificeren en kwantificeren van de componenten in een heterogene mengsel³.

Hoewel microdialysis een gevoelige techniek die kan worden gebruikt is voor het meten van vrijwel elke analyt van belang, is de temporele resolutie laag, met maximale samplingfrequenties volgorde van minuten tot tientallen minuten^1,2. De uitvinding van de snelle scan cyclische voltammetrie (FSCV), een techniek die op het redoxpotentiaal van electroactive soorten berust, kan toelichten in de buurt van de momentane concentraties van de analyt van belang in de extracellulaire vloeistof. In het kort (Zie Robinson et al. ⁴ voor een uitgebreide review), een elektrode wordt toegepast om te verhogen en verlagen de spanning in een driehoekige golf mode op een snelle tijd schaal⁴. Wanneer de spanning in het juiste bereik, is de verbinding van belang herhaaldelijk geoxideerd en verminderd. Deze oxidatie en reductie resulteert in een beweging van elektronen waarmee een kleine wisselstroom. Scan tarieven plaatsvinden op de schaal van de sub tweede met oxidatie en reductie van verbindingen die zich voordoen in microseconden. Door af te trekken van de huidige achtergrond gemaakt door de sonde van de resulterende huidige, kan men een spanning vs. huidige perceel uniek is voor elke stof produceren. Aangezien de tijdschaal van de spanning-oscillaties bekend is, kunnen deze gegevens worden gebruikt om een complot van de huidige berekenen als functie van de tijd. De relatieve concentraties van de stof kunnen dus worden vastgesteld zolang het aantal elektronen in elk oxidatie overgebracht en reductie reactie is bekend⁴.

Deze chemische specificiteit en hoge temporele resolutie maken FSCV een krachtige techniek voor het opsporen van veranderende chemische concentraties in vivo. Echter, ondanks deze vele voordelen, deze techniek vereist uitgebreide technische expertise en dure apparatuur en installatie. Verder kunnen niet nonelectroactive neurotransmitters (bijvoorbeeld, glutamaat) worden gemeten met behulp van deze techniek. Gelukkig, technologische ontwikkelingen op het gebied van de elektrochemie⁵, evenals de commercialisering van deze uitvindingen, heeft een relatief eenvoudige benadering voor het meten van niet-electroactive neurotransmitters in wakker gedragend dieren zonder afbreuk te doen aan temporele precisie-een techniek die bekend staat als de enzymatische biosensor technologie. Deze techniek maakt gebruik van enzymatische omzetting van de neurotransmitter van het nonelectroactive van belang in twee substraten, waarvan er één is electroactive waterstofperoxide die wordt herkend als een amperometrische oxidatie huidige gegenereerd door een toegepaste potentieel⁵ . Verkrijgbare biosensor sondes meten (Zie Figuur 1) selectief analyten van belang door het concurrerend het verminderen van de bijdrage van endogene interferents. In het geval van glutamaat, is de bijdrage van de gemeenschappelijke interferent ascorbinezuur (AA) concurrerend teruggebracht tot de gemeten huidige door mede lokaliseren AA oxidase actieve enzymatische oppervlak van de sensor, AA omzetten in niet-electroactive dihydroascorbate en water. Daarnaast sluit een negatief geladen Nafion polymeer laag aanwezig onder de laag van het enzym endogene anionogene stoffen.

Deze dezelfde biosensor experimentele opstelling kan meten electroactive neurotransmitters zoals in FSCV, maar in plaats daarvan het maakt gebruik van een vaste-potentieel opname-⁶. In tegenstelling tot de oscillerende spanning toegepast in FSCV, in een vaste-potentieel opname wordt de spanning gehouden op de redox potentiële voor de analyt van belang. Hoewel er minder chemisch selectieve dan FSCV zoals meerdere neurotransmitters wellicht de potentiële, dezelfde redox in hersengebieden die overweldigend scheef naar een neurotransmitter, de turn-key aard van deze aanpak opweegt tegen het gebrek aan chemische specificiteit.

De mogelijkheid voor het meten van zowel electroactive als nonelectroactive neurotransmitter release in in de buurt van real-time en koppelen aan specifieke gedrags gebeurtenissen biedt de mogelijkheid te onderzoeken van convergerende neurotransmitter release. Dit manuscript gegevens het gebruik van dit systeem om te ondervragen van zowel glutamaat als dopamine transmissie in reactie op natuurlijke beloning in wakker gedragend hamsters. Het doel van deze paper is voor detail van het proces voor het meten van deze release neurotransmitter tijdens seksueel gedrag in vrouwelijke hamsters, met het doel van het aantonen van de haalbaarheid ervan voor de behandeling van andere gedragingen en experimentele paradigma’s.

Hamsters zijn een ideaal model voor gebruik in elektrochemische opnames
Historisch, zijn rat en muizen modellen tewerkgesteld in de studie van seksueel gedrag. Deze knaagdiersoort deelnemen aan een dynamische copulatory reeks, waarbij talrijke vrouwelijke solicitation gedragingen die zijn hoppen, onstuimig en oor wiggling om te verleiden de man om te jagen en uiteindelijk het monteren van de vrouwelijke⁷. De montage door het mannetje (met of zonder vaginale penetratie) duurt slechts een paar seconden, waarin het vrouwtje houdt zich bezig met haar seksueel gedrag houding (zogenaamde lordose) ook alleen voor een paar seconden voordat het hervatten van actieve solicitation gedrag. Dit patroon van gedrag, samengesteld van hoge niveaus van activiteit afgewisseld met korte periodes van immobiliteit, is problematisch voor het meten van de transmissie in het gedrag van dieren. Ten eerste kan er bewegingsartefacten in de amperometrische opnames die geen verband met neurale activiteit houden. Ten tweede, de motoriek wordt geassocieerd met de release van bepaalde neurotransmitters in bepaalde hersengebieden. Bijvoorbeeld, heeft dopamine release zijn gekoppeld aan de motorische activiteit in de dorsale en ventrale striatum^8,9, een bevinding dat vormde de basis voor microdialysis metingen van dopamine na psychostimulantia administratie¹⁰. Omdat het gedrag van de vrouw-typische verzoek in Mndt knaagdieren betrekken van hoge niveaus van motorische activiteit, en worden vertegenwoordigd door het grootste deel van een 10 minuten seksueel gedrag test, dit maakt het moeilijk om veranderingen in transmissie toeschrijven aan de expliciete componenten van seksueel gedrag dat collectief slechts duren minuten.

Om de neurochemical Profiel van vrouwelijke seksuele gedrag te analyseren, deze lab zocht een soort waarin er is minimale motorische activiteit begeleidende seksueel gedrag. De volgorde van de copulatory in Syrische hamsters (Mesocricetus auratus) is ideaal voor neurochemical opnames als gevolg van het gebrek aan solicitation gedrag meestal gezien bij ratten en muizen¹¹. Dientengevolge, zal vrouwelijke hamsters invoeren en handhaven van de houding van de lordose voor meer dan 9 minuten uit een 10 minuten test sessie¹². Met het ontbreken van vreemde motorische bewegingen door de vrouwelijke, in vivo kunnen elektrochemische opnamen dat geassocieerd met componenten van seksuele interacties met de man worden kunnen worden verkregen.

Copulatory bouts in hamsters
Na de invoering van een mannelijke stimulans dier in de test kamer, zal het mannetje aanvankelijk deelnemen aan anogenital onderzoek (AI) van het vrouwtje vóór montage vanhaar (Figuur 2). Om de man te monteren, moet het vrouwtje een receptieve seksuele houding bekend als lordose, waarin ze bogen op haar rug en haar staart afbuigt, zodat de montage man penile toegang tot haar vagina krijgen kan nemen. Het mannetje zal het vrouwtje, omklemde haar achtervoeten met beide poten (Figuur 2,B), mount en beginnen stak in een poging om penile intromission (Figuur 2C). Het mannetje zal het vrouwtje (zonder invoegpositie) mount evenals intromit een aantal keren alvorens uiteindelijk te bereiken ejaculatie. Deze opeenvolging van monturen en intromissions leidt tot ejaculatie is een “copulatory bout” genoemd. Mannetjes zullen hebben verschillende copulatory bouts binnen een enkele sessie.

Protocol

alle procedures die hier beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Minnesota en zijn in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren 13 . 1. dieren en chirurgie van de Cannulation verkrijgen Syrische hamsters van een gemeenschappelijke dierlijke leverancier op de leeftijd van ongeveer 55 dagen. Opmerking: Hoewel de leeftijd van de dieren, wegens de be…

Representative Results

Elektrochemische en gedrags methodologie hierboven beschreven codering gebruikt, is deze lab begonnen te karakteriseren van zowel tonic en phasic schommelingen in zowel glutamaat als dopamine tijdens in vivo opnames van seksueel gedrag. Als gevolg van de stoffelijk-nauwkeurige wijze van deze methode, kunnen wij nauwkeuriger karakteriseren transmissie tijdens seksueel gedrag; evenals specifieke veranderingen in de vrijlating toeschrijven aan overeenkomstige tonic veranderingen tij…

Discussion

Hoewel betrekkelijk eenvoudig, sommige problemen zich kunnen voordoen wanneer deze techniek in dienst. Ten eerste, de stereotaxic plaatsing van de sondes moet precies: in tegenstelling tot microdialysis die een bredere straal van de extracellulaire omgeving rond de sonde monsters, deze techniek alleen maakt het mogelijk de meting van een neurotransmitter die rechtstreeks in aanraking komt met de sonde. Ten tweede, in het geval van de opname van koolstofvezel, als gevolg van de kleine breedte van vezel, breuk kan optreden…

Materials

Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free–available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.