Summary

Измерения в естественных условиях изменения внеклеточного нейротрансмиттеров в ходе естественно награждение поведения в женских сирийских хомяков

Published: September 12, 2017
doi:

Summary

Этот документ подробно использования фиксированной потенциал Амперометрическое записей с использованием углеродного волокна электродов и ферментативные биосенсор технологии для измерения выпуска допамина и глутамата с высоким временным разрешением во время естественного награждение поведения в Женский хомяк.

Abstract

Возможность нейромедиатора релиз в масштабе быстрого времени измерения позволяет модели синапсах увязываться с конкретным поведением или манипуляций; Это мощный инструмент в изучение основополагающих механизмов и схем. В то время как метод микродиализом был использован на протяжении десятилетий для измерения почти любой аналита интерес в головном мозге, этот метод ограничен временного разрешения. Кроме того быстрое сканирование циклической вольтамперометрии височно точные и чрезвычайно чувствительных; Однако потому что это технически сложным метод основывается на electroactivity аналита интерес, исключается возможность обнаружить nonelectroactive веществ (например, нейромедиатора глутамата). Этот документ подробно описывает использование системы под ключ, которая сочетает в себе amperometry-потенциал и ферментативные biosensing для измерения Электроактивные и nonelectroactive нейротрансмиттеров с височной точностью. Сопряжения этих двух мощных методов позволяет для измерения тоник и фазовые синапсах с относительной легкостью и позволяет одновременно с записью нескольких нейротрансмиттеров. Цель этой рукописи – продемонстрировать процесс измерения допамина и глутамата синапсах в естественных условиях с помощью естественно награждение поведения (т.е., сексуального поведения) в женских хомяков, с конечной целью отображения Техническая осуществимость этого анализа для изучения других поведений и экспериментальных парадигм.

Introduction

Возможность измерения нейромедиатора релиз в бодрствовать поведения животных позволяет исследователям увязать конкретные режимы с пространственных и временных моделей синапсах-мощный инструмент для изучения механизмов и схем, лежащие в основе обоих природных и оперантной поведение в режиме реального времени. Исторически микродиализом был нанят для измерения в внеклеточной средой мозга1электрически реактивной и неспекающиеся веществ. Этот метод использует непрерывный поток водный раствор аналогичные ионного состава внеклеточной жидкости через зонд микродиализом, состоит из небольшой вал с наконечником из полупроницаемых полые волокна мембраны2. После введения зонда, медиаторы или другие аналитов интерес может пересечь полупроницаемой мембраны путем пассивной диффузии перед будучи собиранными высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), интервалы для последующего анализа Техника аналитическая химия, обычно используются для разделения, определить и количественно компонентов в гетерогенных смесь3.

Хотя микродиализом является чувствительной технологией, которая может использоваться для измерения практически любой аналита интерес, временное разрешение низка, с максимальной частотой дискретизации по приказу минут до десятков минут1,2. Изобретение быстрого сканирования циклической вольтамперометрии (FSCV), техника, которая опирается на redox потенциал Электроактивные видов, можно выяснить вблизи мгновенной концентрации аналита интерес в внеклеточной жидкости. В краткой (см. Робинсон и др. 4 для обширный обзор), электрод применяется для поднятия и опускания в треугольная волна моды на быстрое время шкала4напряжение. Когда напряжение находится в допустимом диапазоне, соединение интереса неоднократно окисляется и уменьшена. Этот окисления и сокращение приводит в движение электронов, которое создает небольшой переменный ток. Сканировать курсы проходят на шкале секунды с окислением и сокращение соединений, происходящих в микросекундах. Вычитанием фона текущего созданные зонда от тока, один может генерировать напряжение vs. текущие сюжет, уникальные для каждого соединения. Поскольку шкала времени колебаний напряжения, как известно, эти данные могут использоваться для вычисления участок тока как функцию от времени. Таким образом относительной концентрации комплекса может быть определено до тех пор, как количество электронов, переданных в каждом окисления и снижение реакции, как известно,4.

Эта химическая специфика и высокое временнóе разрешение сделать FSCV мощный метод для обнаружения изменения концентрации химических веществ в естественных условиях. Однако несмотря на эти многочисленные преимущества, этот метод требует обширных технических знаний и дорогостоящее оборудование и установки. Кроме того nonelectroactive нейромедиаторов (например, глутамата) не может измеряться с помощью этой техники. К счастью технологических достижений в области электрохимии5, а также коммерциализации этих изобретений, ввела сравнительно простой подход для измерения не Электроактивные нейротрансмиттеров в бодрствовать поведения животных без ущерба для временных метод точности а, известный как ферментативные биосенсор технологии. Этот метод использует Энзиматическая конверсия нейромедиатор nonelectroactive интерес в двух подложек, одним из которых является Электроактивные перекиси водорода, которая определяется как окисление Амперометрическое текущего генерируется прикладной потенциал5 . Коммерчески доступных биосенсор зонды (см. Рисунок 1) избирательно измерить аналитов интереса конкурсно уменьшая вклад эндогенного счётчик. В случае глутамата вклад общей interferent аскорбиновой кислоты (AA) конкурсно уменьшен для измерения тока совместно локализации оксидазы AA на активной ферментативные поверхность датчика, преобразование АА не Электроактивные dihydroascorbate и вода. Кроме того отрицательно заряженных Nafion полимерный слой под слоем фермента исключает эндогенных анионные соединений.

Этот же биосенсор экспериментальной установки можно измерить Электроактивные медиаторы как FSCV, но вместо этого он использует фиксированный потенциал записи6. В отличие от колебаний напряжения в FSCV в записи фиксированной потенциал напряжения хранится в redox потенциал для аналита интерес. Хотя это менее химически селективным, чем FSCV, как несколько нейротрансмиттеров, возможно же окислительно-восстановительного потенциала, в областях мозга, которые преимущественно наклон к одной нейромедиатора, ключ характер этого подхода перевешивает отсутствие химического специфика.

Возможность измерить Электроактивные и nonelectroactive нейромедиатора релиз в режиме реального времени и связать его с конкретных поведенческих событий предоставляет возможность изучить сходящихся нейромедиатора релиз. Эта рукопись подробности использования этой системы допросить допамина и глутамата синапсах в ответ на природные награду в бодрствования себя хомяков. Цель этого документа заключается в деталях процесс измерения этого нейромедиатора релиз во время сексуального поведения в женских хомяков, с целью продемонстрировать свои возможности для изучения других поведений и экспериментальных парадигм.

Хомяков являются идеальной моделью для использования в электрохимических записи
Исторически крыс и мышей модели были использованы в исследовании сексуального поведения. Эти виды грызунов заниматься динамической копулятивного последовательности, с участием многочисленных женских тендерной поведения, которые включают скачкообразной, бросаясь и уха шевелить побудить мужчин и погони и в конечном итоге монтировать девушки7. Монтаж, самец (с или без вагинального проникновения) длится всего несколько секунд, в течение которых женщина участвует в ее сексуальное поведение осанки (называемых лордоз) также только на несколько секунд, прежде чем возобновить активные тендерной поведения. Эта модель поведения, состоящий из высокий уровень активности, перемежаются с короткими периодами бездействия, является проблематичным для измерения в синапсах поведение животных. Во-первых может быть движение артефакты в Амперометрическое записи, которые не связаны с нервной деятельности. Во-вторых локомоции ассоциируется с выпуском определенной нейротрансмиттеров в определенных областях мозга. К примеру допамина релиз был соединен двигательной активности в дорсальной и вентральной стриатума8,9, что является основой для измерения микродиализом дофамина, после психостимулятор Администрация10. Потому что девушки типичный тендерной поведения в МОСt грызунов включают высокий уровень двигательной активности и представлены основная часть теста сексуального поведения 10 минут, это делает его трудно приписать явного компоненты сексуального поведения, которые коллективно только последние изменения в синапсах минут.

Чтобы проанализировать нейрохимических профиль женского сексуального поведения, эта лаборатория разыскал видов, в котором есть минимальный двигательной активности, сопровождающие сексуальное поведение. Копулятивного последовательности в сирийских хомяков (Mesocricetus auratus) идеально подходит для нейрохимических записей из-за отсутствия тендерной поведения обычно видели в крыс и мышей11. Как следствие женщины хомяков будет вводить и обновлять лордоз позы для свыше 9 минут 10 минут тестирования сессии12. С отсутствием посторонних опорно движений, женщина, в естественных условиях могут быть получены электрохимических записей, которые могут быть связаны с компонентами сексуальных взаимодействий с мужчиной.

Копулятивного схватки в хомяков
После введения мужской стимул животного в испытательной камере самец будет первоначально участвовать в аногенитальной области расследования (AI) самка перед монтажомее (Рисунок 2). Чтобы мужчина для монтирования самка должны взять восприимчивы сексуальные позы, известный как лордоз, в котором она арки ее обратно и отклоняет ее хвост, так что мужчины монтажа может получить полового члена доступ к ее влагалище. Мужчина будет смонтировать самка, обхватив ее конечности с обеими лапами (рис. 2B) и начать, засовывая в попытке получить intromission полового члена (рис. 2C). Мужчина будет смонтировать самка (без вставки), а также intromit несколько раз, прежде чем в конечном итоге достижение эякуляции. Эта последовательность крепления и вмешательство приводит к эякуляции, называется «копулятивного бой». Мужчины будут иметь несколько копулятивного приступами в течение одной сессии.

Protocol

все описанные здесь процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) университета Миннесоты и в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных 13 . 1. животных и катетеризации хирургии по…

Representative Results

С использованием электрохимических и поведенческих кодирования методологии, описанной выше, эта лаборатория начал характеризуют тоник и фазовые колебания допамина и глутамата во время записи в естественных условиях сексуального поведения. Благодаря височно-т?…

Discussion

Хотя сравнительно простой, некоторые проблемы могут возникнуть при использовании этой техники. Во-первых, должна быть точной стереотаксического размещение зондов: в отличие от микродиализом, что образцы широкого радиуса внеклеточных среды вокруг зонд, эта техника позволяет только из?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить студентов Даниэль Корус за его помощь, запуск Matlab код и студент Алекс Боттчер за его помощь в управлении поведенческих экспериментов. Этот проект поддерживается NSF IOS 1256799 к R.L.M. и Национальный институт по проблемам злоупотребления наркотиками национальных институтов здоровья под награду номер T32DA007234.

Materials

Nembutal Oak Pharmaceuticals Inc. 76478-501-50 Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. 
Loxicom analgesic  Norbrook Laboratories  6451603670 NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. 
Enroflox antibiotic  Norbrook Laboratories  5552915411 Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D  Merck Animal Health 00061047305 Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws Pinnacle Technologies, Inc. 8111-16 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. 
Dental acrylic (Bosworth Duz-All) Bosworth  166261C  Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup  Pinnacle Technologies, Inc. 8400-K2 Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package Pinnacle Technologies, Inc. 9000-K1 The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. 
Video EQ700 EverFocus camera  package Pinnacle Technologies, Inc.  9000-K10  EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. 
Sirenia Acquisition software Pinnacle Technologies, Inc. Free–available to download from pinnaclet.com Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit Pinnacle Technologies, Inc. 7000-K2-T-BAS  In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). 
Stir plate  Corning 6795-410D Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation PolyScience 8006A11B PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. 
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae Pinnacle Technology, Inc. 7002-CFS Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode Pinnacle Technology, Inc. 7065 Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors  Pinnacle Technology, Inc. 7001  Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae Pinnacle Technologies, Inc. 7030  Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats  Pinnacle Technologies, Inc. 7011  Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.

References

  1. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
  2. Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
  3. Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
  4. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
  5. Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
  6. Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
  7. Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
  8. Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
  9. Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
  10. Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
  11. Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
  12. Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
  13. . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
  14. Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
  15. . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
  16. Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
  17. Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
  18. Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
  19. Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
  20. Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
  21. Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
  22. Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
  23. Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
  24. Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
  25. Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
check_url/fr/56135?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Moore, K. M., Himmler, B. T., Teplitzky, B. A., Johnson, M. D., Meisel, R. L. Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters. J. Vis. Exp. (127), e56135, doi:10.3791/56135 (2017).

View Video