Medición In Vivo cambios en los neurotransmisores extracelulares durante naturalmente gratificante comportamientos en hámsteres sirios femeninos
Summary
Este documento detalla el uso de grabaciones de potencial fijo amperométrico utilizando electrodos de fibra de carbono y la tecnología de biosensores enzimáticos para medir la liberación de dopamina y glutamato con alta resolución temporal durante el comportamiento natural de gratificante en el hamster hembra.
Abstract
La capacidad de medir la liberación de neurotransmisores en una escala de tiempo rápida permite patrones de neurotransmisión vinculados a comportamientos específicos o manipulaciones; una herramienta poderosa en la aclaración de mecanismos y circuitos subyacentes. Mientras que la técnica de microdiálisis se ha utilizado durante décadas para medir casi cualquier analito de interés en el cerebro, esta técnica está limitada en resolución temporal. Por otra parte, voltametría cíclica de barrido rápido es temporal precisa y extremadamente sensible; sin embargo, porque este método técnicamente difícil se basa en la electroactivity del analito de interés, se elimina la posibilidad de detectar sustancias nonelectroactive (por ejemplo, el neurotransmisor glutamato). Este documento detalla el uso de un sistema de llave en mano que combina el potencial fijo Amperometría y enzimática biosensores para medir neurotransmisores electroactivos y nonelectroactive con precisión temporal. El apareamiento de estas dos técnicas de gran alcance permite la medición de neurotransmisión fásica y tónico con relativa facilidad y permite la grabación de múltiples neurotransmisores simultáneamente. El objetivo de este manuscrito es demostrar el proceso de medición de dopamina y glutamato neurotransmisión en vivo mediante un comportamiento naturalmente gratificante (es decir, comportamiento sexual) en hámsteres femeninos, con el objetivo de mostrar la viabilidad técnica de este ensayo para examinar otros comportamientos y paradigmas experimentales.
Introduction
La capacidad de medir la liberación de neurotransmisor en animales comportamiento despiertos permite a los investigadores vincular conductas específicas con patrones espaciales y temporales de la neurotransmisión, una poderosa herramienta para investigar los mecanismos y circuitos subyacentes tanto natural y conductas operante en tiempo real. Históricamente, se ha empleado microdiálisis para medir sustancias eléctricamente reactivas y no reactivas en el medio extracelular del cerebro1. Esta técnica utiliza un flujo continuo de una solución acuosa de composición iónica similar al líquido extracelular, a través de una sonda de microdiálisis compuesto por un pequeño eje con una punta de una fibra hueca semipermeable membrana2. Después de la inserción de la sonda, neurotransmisores u otros analitos de interés pueden cruzar la membrana semipermeable por difusión pasiva antes de ser recogidos a intervalos para posterior análisis por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), un técnica de química analítica utilizada comúnmente para separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla heterogénea3.
Aunque la microdiálisis es una técnica sensible que puede utilizarse para medir cualquier analito de interés, la resolución temporal es baja, con tasas de muestreo máxima del orden de minutos a decenas de minutos1,2. La invención de la voltametría cíclica de barrido rápido (FSCV), una técnica que se basa en el potencial redox de las especies electroactivas, puede aclarar cerca de instantáneas concentraciones del analito de interés en el líquido extracelular. En breve (ver Robinson et al. 4 para una revisión extensa), se aplica un electrodo para subir y bajar la tensión de forma de onda triangular en una escala de tiempo rápido4. Cuando la tensión está en el rango correcto, el compuesto de interés varias veces es oxidado y reducido. Esta oxidación y reducción resulta en un movimiento de electrones que genera una pequeña corriente alterna. Analizar las tasas tendrá lugar en la escala de fracciones de segundos con la oxidación y la reducción de compuestos que ocurren en microsegundos. Restando el actual fondo creado por la punta de prueba de la corriente resultante, uno puede generar una tensión vs actual parcela única a cada uno de ellos. Debido a que la escala de tiempo de las oscilaciones de voltaje, estos datos pueden utilizarse para calcular una parcela de la corriente como función del tiempo. Por lo tanto, pueden determinarse las concentraciones relativas de los compuestos como el número de electrones transferidos en cada oxidación y reacción de reducción se conoce4.
Esta especificidad química y alta resolución temporal que FSCV una técnica poderosa para la detección del cambio de concentraciones químicas en vivo. Sin embargo, a pesar de estas múltiples ventajas, esta técnica requiere amplios conocimientos técnicos y equipo costoso y configuración. Además, nonelectroactive neurotransmisores (por ejemplo, glutamato) no se puede medir usando esta técnica. Afortunadamente, los avances tecnológicos en el campo de la electroquímica5, así como la comercialización de estos inventos, ha introducido un enfoque relativamente sencillo para medir no electroactivos neurotransmisores en animales comportamiento despiertos sin comprometer el temporal precisión, una técnica conocida como tecnología de biosensores enzimáticos. Esta técnica utiliza conversión enzimática del neurotransmisor nonelectroactive de interés en dos substratos, uno de los cuales es el peróxido de hidrógeno electroactivos que es detectado como una oxidación amperométrico actual generada un potencial aplicado5 . Biosensor comercialmente disponibles sondas (ver figura 1) medir selectivamente los analitos de interés competitivos reduciendo la contribución de interferentes endógenos. En el caso del glutamato, la contribución del ácido ascórbico interferencias comun (AA) se reduce competitivamente a la corriente medida por localizar Co oxidasa AA en la superficie enzimática activa del sensor, conversión de AA a no electroactivos dihydroascorbate y agua. Además, una capa de polímero Nafion cargada negativamente presente debajo de la capa de enzima excluye compuestos aniónicos endógenos.
Esta misma configuración experimental de biosensor puede medir electroactivos neurotransmisores como en la FSCV, pero en su lugar emplea un potencial fijo grabación6. En contraste con la tensión oscilante aplicada en FSCV, en una grabación de potencial fijo el voltaje se mantiene en el redox potencial para el analito de interés. Aunque es menos químicamente selectiva que FSCV como múltiples neurotransmisores pueden tener el mismo potencial, de redox en áreas del cerebro que abrumadoramente sesgan hacia un neurotransmisor, la naturaleza de la llave de este enfoque compensa la falta de química especificidad.
La capacidad de medir electroactivos y nonelectroactive liberación de neurotransmisor en casi en tiempo real y un enlace a eventos específicos de comportamiento proporciona una oportunidad para examinar la liberación de neurotransmisor convergentes. Este manuscrito detalla el uso de este sistema para interrogar la neurotransmisión de dopamina y glutamato en respuesta a la natural recompensa en hámsters comportamiento despiertos. El objetivo de este artículo es detallar el proceso de medición esta liberación de neurotransmisores durante el comportamiento sexual en hámsteres femeninos, con el objetivo de demostrar su viabilidad para examinar otros comportamientos y paradigmas experimentales.
Hámsters son un modelo ideal para su uso en grabaciones de electroquímicas
Históricamente, se han empleado modelos de ratas y ratones en el estudio del comportamiento sexual. Estos roedores participan en una secuencia copulatoria dinámica, que involucra numerosos comportamientos de solicitud femenina que incluyen saltos entrando y oído ondulación para atraer al macho a perseguir y finalmente montar la hembra7. El montaje por el hombre (con o sin penetración vaginal) dura sólo unos segundos, durante el cual la hembra se dedica a su postura comportamiento sexual (denominada lordosis) también sólo durante unos segundos antes de volver a comportamientos de solicitud activa. Este patrón de comportamiento, compuesto por altos niveles de actividad intercalados con breves períodos de inmovilidad, es problemático para la medición de la neurotransmisión en comportamiento de animales. En primer lugar, puede haber artefactos de movimiento en las grabaciones de amperométricos que se relaciona con la actividad de los nervios. En segundo lugar, la locomoción se asocia con la liberación de neurotransmisores especialmente en ciertas regiones del cerebro. Por ejemplo, la liberación de dopamina se han unido a la actividad locomotriz en el estriado dorsal y ventral8,9, un hallazgo que formó la base para las mediciones de microdiálisis de dopamina después de psicoestimulantes administración10. Porque los comportamientos de la mujer típica solicitud en mosroedores de t implican altos niveles de actividad locomotora y son representados por la mayor parte de una prueba del comportamiento sexual de 10 minutos, esto hace difícil atribuir los cambios en la neurotransmisión a los componentes explícitos de comportamiento sexual que colectivamente sólo minutos.
Para analizar el perfil neuroquímico del comportamiento sexual femenino, este laboratorio buscó una especie en que existe mínima actividad locomotriz que acompañan el comportamiento sexual. La secuencia de copulación en hamsters sirios (Mesocricetus auratus) es ideal para grabaciones neuroquímicas debido a la falta de comportamientos solicitud típicamente visto en ratas y ratones11. Como consecuencia, hamsters hembra entrará y mantener la postura de lordosis para más de 9 minutos a 10 minutos de prueba sesión12. Con la falta de extraños movimientos locomotores por la mujer, en vivo pueden obtenerse grabaciones electroquímicas que pueden estar asociadas con los componentes de las interacciones sexuales con el varón.
Combates consistieron en hamsters
Después de la introducción de un animal macho de estímulo en la cámara de prueba, el hombre inicialmente participarán en investigación de anogenital (IA) de la hembra antes de montar su (elfigura 2A). En orden para el macho de Monte, la mujer debe asumir una postura sexual receptiva conocida como lordosis, en la que arquea su espalda y su cola se desvía para que el hombre de montaje puede acceder pene a su vagina. El macho montará mujer, juntando su trasero con ambas patas (figura 2B) y comenzar a empujar en un intento por ganar la intromisión del pene (figura 2C). El macho Monte a la hembra (sin inserción), y se intromit varias veces antes de alcanzar finalmente la eyaculación. Esta secuencia de Montes y de intromisiones a la eyaculación se denomina una “pelea de copula”. Los machos tendrá varios combates consistieron en una sola sesión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque relativamente sencilla, algunos temas pueden surgir al utilizar esta técnica. En primer lugar, la colocación estereotáctica de las puntas de prueba debe ser precisa: a diferencia de microdialysis que muestras un radio más amplio del medio extracelular que rodea a la sonda, esta técnica sólo permite la medición de un neurotransmisor que entra en contacto directo con la sonda. En segundo lugar, en el caso de la grabación de la fibra de carbono, debido a la anchura pequeña de la fibra, puede ocurrir una fall…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a licenciatura Daniel Korus por su ayuda ejecutando el código Matlab y pregrado Alex Boettcher por su ayuda en el funcionamiento de los experimentos conductuales. Este proyecto es apoyado por NSF IOS 1256799 a R.L.M. y por el Instituto Nacional sobre abuso de drogas de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número T32DA007234.
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
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