Doğal olarak kadın Suriye hamster davranışları ödüllendirme sırasında hücre dışı nörotransmitter ölçüm Vivo içinde değişimler
Summary
Bu kağıt dopamin ve Glutamat yüksek zamansal çözünürlük ile serbest bırakılması sırasında doğal tatmin edici davranışlara ölçmek için karbon fiber elektrotlar ve enzimatik Biyoalgılayıcı teknoloji kullanarak sabit potansiyel amperometric kayıtları kullanımı detayları kadın hamster.
Abstract
Nörotransmitter yayın bir hızlı zaman ölçeğinde ölçmek için yeteneği belirli davranışları veya manipülasyonlar bağlanacak şekilde neurotransmission şekillerinin sağlar; temel mekanizmaları ve devre elucidating güçlü bir araç. Microdialysis tekniği beyin ilgi hemen hemen her analit ölçmek için yıllardır kullanılan iken, bu teknik de geçici çözüm sınırlıdır. Alternatif olarak, hızlı tarama çevrimsel voltammetry geçici kesin ve son derece hassas biri; Ancak, teknik olarak zor bu yöntem ilgi analitin electroactivity üzerinde kullandığından, nonelectroactive maddeler (örneğin, nörotransmitter Glutamat) algılamak imkanı ortadan kaldırmıştır. Bu kağıt sabit potansiyel amperometry ve electroactive ve nonelectroactive nörotransmitter zamansal hassasiyetle ölçmek için enzimatik biosensing bir araya getiren bir anahtar teslim sistemi ayrıntıları. Bu iki güçlü teknikleri eşleştirme tonik ve phasic neurotransmission ölçüm için göreli kolaylıkla sağlar ve aynı anda birden fazla nörotransmitter kayıt izin verir. Bu yazının amacı görüntüleme nihai hedefi ile kadın hamster içinde doğal olarak tatmin edici davranış (Yani, cinsel davranış) kullanarak dopamin ve Glutamat neurotransmission in vivo ölçme işlemi göstermektir Teknik fizibilite diğer davranışları ve deneysel paradigmalar incelenmesi için bu testin.
Introduction
Nörotransmitter yayın davranıyor uyanık hayvanlarda ölçmek için yeteneği belirli davranışlar mekanizmaları ve her ikisi de temel devresi araştırmak için güçlü aracı neurotransmission bir kayma ve temporal desenleri ile bağlamak araştırmacılar doğal izin verir ve gerçek zamanlı olarak operant davranışları. Tarihsel olarak, microdialysis beyin1ekstraselüler ortamında hem elektrikle reaktif ve tepkisiz maddeler ölçmek için istihdam edilmiştir. Bu teknik ekstraselüler sıvı, benzer iyonik kompozisyon sulu bir çözüm, sürekli bir akış küçük bir şaft bir semipermeable hollow fiber membran2/ yapılan bir ucu ile oluşan bir microdialysis sonda aracılığıyla kullanır. Sonda eklemeden sonra nörotransmitter veya diğer analitler ilgi semipermeable membran daha sonraki analiz için aralıklarla yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC), tarafından toplanmakta önce pasif Difüzyon tarafından çapraz olabilir bir analitik kimya teknik ayırmak için yaygın olarak kullanılan tanımlamak ve heterojen karışım3bileşenlerinde ölçmek.
Microdialysis hemen her analit ilgi ölçmek için kullanılan hassas bir teknik olmasına rağmen zamansal çözünürlük ile dakika dakika1,2onlarca sırasına en yüksek örneklendirme oranı düşüktür. Hızlı tarama çevrimsel voltammetry (FSCV), electroactive türleri, redoks potansiyeli dayanır bir teknik icadı ekstraselüler sıvı ilgi analit anlık konsantrasyonları yakınındaki aydınlatmak. Kısaca (bkz: Robinson vd. 4 için kapsamlı bir inceleme), bir elektrot yükseltmek ve daha düşük bir üçgen dalga moda hızlı zaman ölçeği4gerilim uygulanır. Gerilim daha doğru varsa, bileşik faiz art arda okside azaltılmış ve. Küçük bir alternatif akım oluşturur bir hareket elektronların bu oksitlenmeye ve azaltma sonuçları. Oranları gerçekleşecek oksitlenmeye ve bileşikleri mikrosaniye cinsinden meydana gelen azalma ile alt ikinci ölçekte tarama. Arka plan geçerli elde edilen geçerli yoklama tarafından oluşturulan çıkararak, bir vs geçerli çizim her bileşik için benzersiz bir gerilim oluşturabilir. Gerilim salınımlarını zaman ölçeğini bilinir, bu veri geçerli bir arsa bir fonksiyonu olarak hesaplamak için kullanılabilir. Böylece, bileşik göreli konsantrasyonları aktarılan toplam elektron sayısı her oksidasyon ve Redüksiyon tepki4bilinen olarak belirlenebilir.
Bu kimyasal özgüllük ve yüksek zamansal çözünürlük FSCV kimyasal konsantrasyonu vivo içindedeğişen algılamak için güçlü bir teknik olun. Ancak, bu manifoldu avantajlara rağmen bu teknik kapsamlı teknik uzmanlık ve pahalı ekipman ve kurulum gerektirir. Ayrıca, nonelectroactive nörotransmiterler (örneğin, Glutamat) bu tekniği kullanarak ölçülen olamaz. Neyse ki, elektrokimya5, hem de ticari kullanım bu buluşlar alanında teknolojik gelişmeler electroactive sigara nörotransmitter davranıyor uyanık hayvanlarda ölçmek için nispeten basit bir yaklaşım tanıttı hassas bir enzimatik Biyoalgılayıcı teknoloji olarak bilinen zamansal tekniği ödün vermeden. Bu tekniği kullanan bir uygulanan potansiyel5 tarafından oluşturulan bir amperometric oksidasyon geçerli olarak belirlenen electroactive hidrojen peroksit biri enzimatik nonelectroactive nörotransmitter ilgi içine dönüşüm iki yüzeylerde, . Piyasada bulunan Biyoalgılayıcı sondalar (bkz. şekil 1) seçerek analitler ilgi rekabetçi endojen interferents katkısını azaltarak ölçmek. Glutamat durumunda, ortak interferent askorbik asit (AA) katkısını rekabetçi ölçülen geçerli AA oksidaz AA sigara electroactive için dönüştürme sensörün aktif enzimatik yüzeyine co yerelleştirme tarafından azalır dihydroascorbate ve su. Buna ek olarak, bir olumsuz ücret Nafion polimer tabaka enzim tabakasının altında mevcut endojen iyonik bileşikler içermez.
Bu aynı Biyoalgılayıcı deneysel kurulum-ebilmek ölçü electroactive nörotransmiterler olduğu gibi FSCV ama bunun yerine bir sabit-potansiyel kayıt6kullanır. FSCV içinde uygulanan salınım voltaj aksine, bir sabit-potansiyel kayıt gerilim Redoks faiz analit için potansiyel tutulur. Birden çok nörotransmitter ezici bir çoğunlukla doğru bir nörotransmitter çarpık beyin alanlarda aynı Redoks potansiyeli olabilir gibi FSCV daha az kimyasal olarak seçime bağlı olsa da, bu yaklaşımın komple doğa kimyasal eksikliği daha ağır basar özgüllüğü.
Electroactive ve nonelectroactive nörotransmitter sürümde yakın gerçek zamanlı ölçmek ve belirli davranış olaylara bağlamak için yakınsak nörotransmitter yayın incelemek için bir fırsat sağlar. Bu el yazması yanıt uyanık davranan hamster doğal ödül olarak dopamin ve Glutamat neurotransmission sorguya çekmek için bu sistemi ayrıntıları. Bu kağıt bu nörotransmitter yayın sırasında diğer davranışları ve deneysel paradigmalar incelenmesi için onun fizibilite gösteren amacı ile kadın hamster cinsel davranışlara Ölçme işleminin detay amaçtır.
Elektrokimyasal kayıtları kullanmak için ideal bir model hamster are
Tarihsel olarak, sıçan ve fareler modelleri cinsel davranış çalışmada istihdam edilmiştir. Bu kemirgen türler atlamalı, darting ve kulak kovalamak ve sonuçta mount kadın7erkek ikna için kıpır kıpır dahil çok sayıda kadın talep davranışları içeren bir dinamik çiftleşme sırayla meşgul. Erkek (veya vajinal penetrasyon olmadan) tarafından montaj sırasında etkin talep davranışları sürdürme önce sadece birkaç saniye için ( lordozdenir) onun cinsel davranış duruş da dişi yürütmektedir yalnızca birkaç saniye sürer. Bu davranış, hareketsizlik, kısa süreler ile serpiştirilmiş etkinliği yüksek düzeyde oluşan hayvanlar davranışlar içinde neurotransmission ölçmek için sorunlu kalıptır. İlk olarak, sinirsel aktivite ile ilgili olmayan amperometric kayıtları hareketi eserler olabilir. İkinci olarak, hareket bazı beyin bölgelerinde belirli nörotransmitter sürümü ile ilişkilidir. Örneğin, dopamin yayın dorsal ve ventral striatum8,9, psikostimülan takiben dopamin microdialysis ölçümleri için temel bir bulgu Lokomotor aktivite birleştiğinde Yönetim10. Çünkü erkek tipik talep davranış ecek içindet kemirgenler Lokomotor aktivite düzeyi yüksek içerir ve bir 10 dakika cinsel davranış testi toplu tarafından temsil edilir, bu zor neurotransmission değişimler topluca sadece son açık bileşenleri cinsel davranış için atfetmek yapar dakika.
Nörokimyasal profil sahibi kadın cinsel davranışı çözümlemek için bu laboratuvar cinsel davranış eşlik eden en az Lokomotor aktivite olduğu bir tür aradı. Suriye hamster (Mesocricetus hava) çiftleşme sırayla talep davranışları genellikle görülen sıçanlar ve fareler11eksikliği nedeniyle nörokimyasal kayıtları için idealdir. Sonuç olarak, kadın hamster girmek ve korumak için lordoz duruş 10 dakikalık oturum12test 9 dakika yukarı. Lokomotor hareketlerle yabancı kadın, in vivo eksikliği ile erkek ile cinsel etkileşimlerin bileşenlerle ilişkili olabilir elektrokimyasal kayıtları elde edilebilir.
Çiftleşme nöbetleri hamster içinde
Test odasına erkek uyarıcı hayvan giriş sonra erkek başlangıçta onun (Şekil 2A) montaj önce anogenital soruşturma (AI) kadın meşgul olacak. Sırayla bağlamaya erkek, dişi bir alıcı cinsel duruş içinde onu geri kemerler ve montaj erkek penis vajinaya erişebilirsiniz böylece kuyruğunu saptırır lordoz, olarak bilinen varsaymalıyız. Erkek her iki paws (Şekil 2B), ile onun hindquarters clasping erkek, dağ ve penil sıra (Şekil 2C) elde etmek için bir girişim sokmak başlar. Erkek erkek (olmadan ekleme) mount yanı sıra sonunda boşalma ulaşmak daha önce birkaç kez intromit. Bu bağlar ve boşalma için önde gelen intromissions dizisi “çiftleşme ne dersin” olarak adlandırılır. Erkek-ecek-si olmak birkaç çiftleşme nöbetleri içinde tek bir oturum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nispeten basit olsa da, bazı sorunlar bu tekniği istihdam ortaya çıkabilir. İlk olarak, sondalar stereotaksik yerleşimini kesin olmalıdır: sonda çevreleyen ekstraselüler ortamın daha geniş bir yarıçap örnekleri microdialysis bu teknik yalnızca doğrudan temas gelir bir nörotransmitter ölçüm verir sonda ile. İkinci olarak, kablo, küçük genişliği nedeniyle karbon fiber kayıt durumunda kırılması meydana gelebilir ve sonda kasıtlı bakımı ile eklenmesi gerekir. Sonda garantili-süre içinde 3…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar lisans Daniel Korus onun yardım Matlab kodu çalıştırmak için ve lisans Alex Boettcher davranışsal deney çalışan onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NSF IOS 1256799 R.L.M. için ve ulusal sağlık Enstitüleri Ödülü numarası T32DA007234 altında ilaç kötüye Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
