Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster

Summary

Dieses Papier beschreibt behoben-Potential amperometrischen Bildaufzeichnungen mit Kohlefaser-Elektroden und enzymatische Biosensor-Technologie zur Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat mit hoher zeitlicher Auflösung während natürliche lohnende Verhalten in der weibliche Hamster.

Abstract

Neurotransmitter-Freisetzung auf einer schnellen Zeitskala zu messen, können Muster Neurotransmission in Zusammenhang mit bestimmten Verhaltensweisen oder Manipulationen werden; ein mächtiges Werkzeug in der Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und Schaltung. Während die Technik der Mikrodialyse jahrzehntelang verwendet worden ist, um nahezu jeden Analyten von Interesse im Gehirn zu messen, ist diese Technik in zeitlicher Auflösung begrenzt. Alternativ ist Schnellscan zyklischer Voltammetrie zeitlich präzise und extrem empfindlich; Da diese technisch schwierige Methode stützt sich auf die Electroactivity des Analyten von Interesse, entfällt jedoch die Möglichkeit, Nonelectroactive Substanzen (z.B. der Neurotransmitter Glutamat) zu erkennen. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von ein Turnkey-System, das feste Potenzial strommesstechnik und enzymatische Biosensoren elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter mit zeitlichen Präzision zu messen. Die Paarung dieser beiden leistungsfähigen Methoden ermöglicht die Messung der tonischen und phasischen Neurotransmission mit relativer Leichtigkeit und ermöglicht die Aufnahme von mehreren Neurotransmittern gleichzeitig. Dieses Manuskript soll den Prozess der Messung von Dopamin und Glutamat Neurotransmission in Vivo mit einem natürlich lohnende Verhalten (d. h., Sexualverhalten) in weibliche Hamster, mit dem Ziel der Darstellung zeigen die technische Machbarkeit des Assays für die Prüfung anderer Verhaltensweisen und experimentelle Paradigmen.

Introduction

Die Fähigkeit zur Messung der Neurotransmitter-Freisetzung in wach Verhalten Tiere erlaubt Forschern, bestimmte Verhaltensweisen mit räumlichen und zeitlichen Muster der Neurotransmission, ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, Mechanismen und Schaltung zugrunde liegen beide verbinden natürliche und das operante Verhalten in Echtzeit. In der Vergangenheit wurde Mikrodialyse eingesetzt, um sowohl elektrisch reaktiver und nichtreaktiven Stoffe in das extrazelluläre Milieu des Gehirns¹messen. Diese Technik verwendet einen kontinuierlichen Fluss von einer wässrigen Lösung ähnlicher ionische Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit durch eine Mikrodialyse-Sonde besteht aus einer kleinen Welle mit einer Spitze eines halbdurchlässigen Hohlfaser-Membran²gemacht. Nach dem Einführen der Sonde, Neurotransmitter oder anderen Analyten von Interesse können die halbdurchlässige Membran durch passive Diffusion vor gesammelt in Abständen für die spätere Analyse durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), überqueren eine analytische Chemie Technik häufig genutzt, um zu trennen, identifizieren und quantifizieren Komponenten in eine heterogene Mischung³.

Obwohl Mikrodialyse eine sensible Technik, die verwendet werden ist, um praktisch jede Analyten von Interesse zu messen, ist die zeitliche Auflösung gering, mit maximalen Sampling-Raten in der Größenordnung von bis zu zehn Minuten^1,2Minuten. Die Erfindung des schnellen Scan zyklischer Voltammetrie (FSCV), eine Technik, die stützt sich auf das Redoxpotential elektroaktive Spezies, kann in der Nähe von momentanen Konzentration des Analyten von Interesse in der extrazellulären Flüssigkeit aufzuklären. In Kürze (siehe Robinson Et Al. ⁴ für eine umfassende Überprüfung), eine Elektrode wird angewendet, um heben und senken die Spannung in einem Dreieckswelle Mode auf eine schnelle Zeit Skala⁴. Wenn die Spannung in den richtigen Bereich ist, wird die Verbindung von Interesse immer wieder oxidiert und reduziert. Diese Oxidation und Reduktion führt zu einer Bewegung der Elektronen, die eine kleinen Wechselstrom erzeugt. Scannen Sie Preise statt auf der Skala von unter einer Sekunde mit Oxidation und Reduktion von Verbindungen, die in Mikrosekunden. Durch Subtraktion Hintergrund aktuelle von der Sonde aus der resultierende Strom erzeugt, kann man eine Spannung vs. aktuelle Plot einzigartig für jede Verbindung erzeugen. Da die Zeitskala der Spannung Schwingungen bekannt ist, können diese Daten verwendet werden, um eine Darstellung des Stromes als Funktion der Zeit zu berechnen. Also, können die relative Konzentration der Verbindung ermittelt werden, solange die Anzahl der Elektronen bei jeder Oxidation übertragen und Reduktion man^{4 bezeichnet}.

Diese chemische Spezifität und hoher zeitlicher Auflösung machen FSCV ein leistungsfähiges Verfahren zur Erkennung von chemischen Konzentrationen in Vivoändern. Trotz dieser vielfältigen Vorteile erfordert diese Technik jedoch umfangreiches Fachwissen und teure Ausrüstung und Einrichtung. Darüber hinaus können nicht Nonelectroactive Neurotransmitter (z.B. Glutamat) mit dieser Technik gemessen werden. Technologische Fortschritte auf dem Gebiet der Elektrochemie⁵sowie Kommerzialisierung dieser Erfindungen hat glücklicherweise einen relativ einfachen Ansatz nicht elektroaktive Neurotransmitter im wach Verhalten Tiere messen eingeführt ohne zeitliche Präzision-a Technik bekannt als enzymatische Biosensor-Technologie. Diese Technik verwendet enzymatische Umwandlung des Neurotransmitters Nonelectroactive von Interesse in beiden Substrate elektroaktive Wasserstoffperoxid dazu gehört, das als eine amperometrischen Oxidation aktuelle erzeugt durch eine angewandte Potential^{5 erkannt wird} . Handelsübliche Biosensor-Sonden messen (siehe Abbildung 1) selektiv Analyten von Interesse von wettbewerbsfähigen Verringerung des Beitrags der endogenen Interferents. Im Falle von Glutamat der Beitrag der gemeinsamen interferent Ascorbinsäure (AA) konkurrierend der gemessene Strom sinkt auf durch Co Lokalisierung AA Oxidase auf die aktive enzymatische Oberfläche des Sensors nicht elektroaktive AA umwandeln Dihydroascorbate und Wasser. Darüber hinaus schließt eine negativ geladene Nafion Polymerschicht unter der Enzym-Schicht endogene anionische Verbindungen.

Diese gleichen Biosensor Versuchsaufbau kann elektroaktive Neurotransmitter wie in FSCV messen, aber es setzt stattdessen eine feste Potenzial Aufnahme⁶. Im Gegensatz zu der oszillierende Spannung in FSCV wird in eine feste-Potential-Aufnahme die Spannung auf den Redox Potenzial für den Analyten von Interesse gehalten. Zwar weniger chemisch selektive als FSCV, da mehrere Neurotransmitter die gleichen Redoxpotential in Hirnarealen haben können, die überwiegend in Richtung eines Neurotransmitters verzerren, überwiegt die schlüsselfertige Natur dieses Ansatzes das Fehlen von chemischen Spezifität.

Die Fähigkeit, elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter-Freisetzung in nahezu in Echtzeit zu messen und verknüpfen es mit bestimmten Verhaltens Ereignissen bietet Gelegenheit, konvergierenden Neurotransmitter-Freisetzung zu untersuchen. Dieses Manuskript erläutert die Verwendung dieses Systems, Dopamin und Glutamat Neurotransmission in Reaktion auf natürliche Belohnung in wach Verhalten Hamster zu befragen. Das Ziel dieses Papiers ist es, ausführlich den Prozess der Messung dieser Neurotransmitter-Freisetzung während Sexualverhalten in weiblichen Hamster, mit dem Ziel, die Machbarkeit für die Prüfung anderer Verhaltensweisen und experimentelle Paradigmen zu demonstrieren.

Hamster sind ein ideales Modell für den Einsatz in elektrochemischen Aufnahmen
Historisch gesehen, sind Ratten und Mäuse-Modelle in der Studie des Sexualverhaltens eingesetzt worden. Diese Nagetierarten engagieren sich in einer dynamischen Abfolge copulator, an denen zahlreiche weibliche Aufforderung Verhaltensweisen, die zählen-hopping, stechen und Ohr wackeln um das Männchen zu jagen und letztlich die weibliche⁷montieren zu verleiten. Die Montage durch das Männchen (mit oder ohne vaginale Penetration) dauert nur wenige Sekunden, in denen das Weibchen in ihrem Sexualverhalten Haltung (genannt Lordose) auch nur für ein paar Sekunden vor der Wiederaufnahme der aktiven Aufforderung Verhaltensweisen greift. Dieses Verhaltensmuster, bestehend aus hoher Aktivität, durchsetzt mit kurzen Perioden der Unbeweglichkeit, ist problematisch für die Messung von Neurotransmission im Verhalten der Tiere. Erstens kann der amperometrischen Aufnahmen, die nicht im Zusammenhang mit neuronalen Aktivität sind Bewegungsartefakte sein. Zweitens ist die Fortbewegung mit der Freisetzung von bestimmten Neurotransmittern in bestimmten Gehirnregionen verbunden. Zum Beispiel ist Dopamin-Freisetzung lokomotorischen Tätigkeit in den dorsalen und ventralen Striatum^8,9, Feststellung gekuppelt, die die Grundlage für die Mikrodialyse Messungen von Dopamin nach Psychostimulans gebildet Verwaltung-¹⁰. Weil die weiblich-typischen Aufforderung Verhaltensweisen in Most Nagetiere hoher lokomotorische Aktivität beinhalten und sind durch die Masse eines 10-minütigen Sexualverhalten Tests vertreten, dies macht es schwierig, die explizite Komponenten des Sexualverhaltens Veränderungen der Neurotransmission zuschreiben, die gemeinsam nur dauern Minuten.

Um die neurochemischen Profil des weiblichen Sexualverhaltens zu analysieren, diese Übungseinheit suchte eine Spezies gibt es minimale lokomotorischen Tätigkeit begleitende Sexualverhalten. Die copulator-Sequenz in syrischen Hamster (Mesocricetus Auratus) ist ideal für neurochemischen Aufnahmen Mangels Aufforderung Verhaltensweisen in der Regel bei Ratten und Mäusen¹¹gesehen. Infolgedessen werden weibliche Hamster eingeben und verwalten die Lordose-Haltung für bis zu 9 Minuten aus einen 10-minütigen Sitzung¹²testen. Mit dem Mangel an fremde lokomotorischen Bewegungen durch das weibliche, in Vivo erhalten Sie elektrochemische Aufnahmen, die Komponenten des sexuellen Interaktionen mit den männlichen zugeordnet werden können.

Copulator Kämpfe im Hamster
Nach der Einführung eines männlichen Reiz Tieres in der Prüfkammer wird das Männchen zunächst anogenitalen Untersuchung (AI) der Frau vor der Montage ihrer (Abb. 2A) führen. In Reihenfolge für das Männchen zu montieren muss das Weibchen übernehmen eine rezeptive sexuelle Haltung bekannt als Lordose, in denen sie wölbt sich ihr Rücken und ihr Schweif ablenkt, so dass die Montage männlichen Penis zu ihrer Vagina zugreifen kann. Das Männchen wird das Weibchen, umklammert ihre Hinterhand mit beiden Pfoten (Abbildung 2B), montieren und beginnen, in einem Versuch zu Penis eindringen (Abbildung 2C) stieß. Das Männchen wird montieren Sie das Weibchen (ohne Aufnahme) sowie etliche Male bevor Sie erreichen schließlich Ejakulation geleiten. Diese Abfolge von Halterungen und haftet führt die Ejakulation wird einen “copulator Kampf” bezeichnet. Männchen haben mehrere copulator Kämpfe innerhalb einer einzigen Sitzung.

Protocol

alle hier beschriebene Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Minnesota genehmigt und stehen im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 13 . 1. Tiere und Kanülierung Chirurgie erhalten syrischen Hamster aus einer gemeinsamen Tier in ca. 55 Tage alt. Hinweis: Obwohl das Alter der Tiere wegen Einschränkungen der verschiedenen experimentellen Paradigme…

Representative Results

Mit der elektrochemischen und Verhaltensstörungen Codierung oben beschriebenen Methodik, hat dieser Übungseinheit begonnen, tonischen und phasischen Schwankungen von Dopamin und Glutamat bei in-Vivo -Aufnahmen des Sexualverhaltens zu charakterisieren. Durch die zeitlich genaue Art dieser Methodik können wir genauer Neurotransmission während sexuelles Verhalten charakterisieren; sowie zuschreiben bestimmte Änderungen in Release-Muster mit entsprechenden tonischen Veränderung…

Discussion

Obwohl relativ einfach, können einige Probleme entstehen, wenn diese Technik beschäftigt. Erstens muss die stereotaktischen Platzierung der Sonden präzise sein: im Gegensatz zu Mikrodialyse, die einen größeren Radius das extrazelluläre Milieu rund um die Sonde zu Proben, ermöglicht diese Technik nur die Messung eines Neurotransmitters, die direkt in Berührung kommt mit der Sonde. Zweitens bei der Kohlefaser-Aufnahme durch die geringe Breite der Faser, Bruch auftreten kann, und die Sonde muss mit bewusste Sorgfalt…

Materials

Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free–available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.