当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定
Summary
自然やりがいのある行動の中にドーパミンやグルタミン酸高時間分解能のリリースを測定する炭素繊維電極と酵素バイオ センサー技術を使用して固定電位電流記録の使用の詳細を説明しますメスのハムスター。
Abstract
急速な時間スケールでの伝達物質の放出を測定する機能により、特定の動作または操作にリンクする神経伝達のパターン基になる機構と回路の解明で強力なツールです。マイクロダイアリシス法は、脳に興味のほぼすべての検体を測定する何十年も使用されています、この手法時間的解像度に限界があります。また、高速循環ボルタンメトリーは一時的に正確な非常に敏感です。ただし、技術的に困難な本法は興味の analyte の electroactivity に依存しているので、nonelectroactive 物質 (例えば、神経伝達物質グルタミン酸) を検出する可能性がなくなります。固定ポテンシャルをアンペロメトリーと時空間精度ゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質を測定する酵素バイオ センサーを組み合わせたターンキー システムの使用の詳細を説明します。これらの 2 つの強力な技術の組み合わせ、比較的簡単に強壮剤や一過性の神経伝達の測定により、複数の神経伝達物質の同時録音が可能します。本稿の目的は、ドーパミンやグルタミン酸神経伝達体内表示の究極の目標をハムスターの (すなわち、性行動) 当然のことながらやりがいのある動作を使用して測定のプロセスを示すため、その他の行動および実験パラダイムを調べるためこのアッセイの技術的可能性は。
Introduction
目を覚まし行動中の動物の伝達物質の放出を測定する機能により、神経伝達の両方を生み出す機構と回路を調査するための強力なツールの時空間パターンの特定の動作をリンクする研究者自然リアルタイムでオペラント行動。歴史的に、脳1の細胞外の環境の両方の電気的反応性、非反応性の物質を測定するマイクロダイアリシスを採用されています。この技法は、先端が中空の半透膜2の小さいシャフトから成るマイクロダイアリシス プローブを細胞外液に類似のイオン組成の水溶液の連続的な流れを使用します。高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、によってその後の分析のための間隔で収集される前に受動の拡散によって半透膜が出来る神経伝達物質または興味の他の検体プローブの挿入後、分析化学技術を区切るには、一般に利用を識別して異種混合物3のコンポーネントを定量化します。
マイクロダイアリシス興味の事実上すべての検体を測定する使用することができます敏感な手法ですが、時間の分解能は低く、およそ万分1,2分の最大サンプリング レート。高速スキャン サイクリックボルタンメトリー (FSCV)、電気活性種の酸化還元電位に依存する技術の発明は、細胞外液に興味の analyte の瞬時濃度近く解明できます。簡単に言うと (ロビンソンらを参照してください。4広範なレビューのため)、速い時間スケール4三角波ファッションに電圧を上下させる電極を適用します。電圧は、適切な範囲で、目的の化合物が繰り返し酸化して縮小しました。この酸化し削減微小交流電流を作成する電子の動きになります。スキャン レート酸化マイクロ秒単位で発生している化合物の還元とサブ秒スケールの場所を取る。現在の結果からのプローブによって作成された現在の背景を引く、現在プロットの各化合物に固有対の電圧を生成できます 1 つ。電圧振動のタイム スケールが知られているので、これらのデータは、現在のプロットを時間の関数として計算する使用できます。したがって、各酸化で転送された電子の数と還元反応が4を知られている限りは、化合物の相対濃度が決定されるかもしれない。
この化学的特異性と高い時間分解能 FSCV体内の化学成分の濃度変化を検出するための強力な技術を確認します。ただし、これらのマニホールドの利点にもかかわらず技術的なノウハウと高価な機器、セットアップにこのテクニックが必要。さらに、この手法を使用して、nonelectroactive 神経伝達物質 (例えばグルタミン酸) を測定できません。幸いなことに、これらの発明の商品化と同様、電気化学5の分野で技術の進歩は目を覚まし行動中の動物の非ゲルロボットの神経伝達物質を測定する比較的単純なアプローチを導入しています時間精度、テクニックを損なうことがなく酵素バイオ センサー技術として知られています。この手法は、あるゲルロボット過酸化水素応用可能性5 によって生成されたアンペロ メトリック酸化電流として検出される 2 枚の基板に関心の nonelectroactive 神経伝達物質の酵素的変換を使用してください。.市販バイオ センサー プローブ選択的に競争力のある内因性接しないの貢献を減らすことによって興味の検体を測定 (図 1参照)。グルタミン酸、場合共通 interferent アスコルビン酸 (AA) の貢献は競争力のある減測定電流に共同非ゲルロボット AA に変換するセンサーの活性酵素表面に AA オキシダーゼのローカライズdihydroascorbate と水。さらに、酵素層の下に存在負荷電ナフィオン膜は内因性アニオン性化合物を除外します。
この同じバイオ実験のセットアップは、FSCV のようにゲルロボットの神経伝達物質を測定できますが、代わりにそれは固定電位記録6を採用しています。FSCV で、振動電圧とは対照的で固定電位記録電圧は抑えている酸化還元で興味の analyte の潜在的です。このアプローチのターンキーの性質が化学物質の欠如を上回る圧倒的に 1 神経伝達物質に向かって傾斜する脳領域の同じ酸化還元電位、あるかもしれない複数の神経伝達物質として FSCV より少ない化学選択的ですが、特異性。
ほぼリアルタイムでゲルロボットと nonelectroactive の両方の神経伝達物質解放を測定し、特定の行動イベントにリンクする機能では、収束の伝達物質の放出を検討する機会を提供します。この原稿は、目を覚まし行動ハムスターにおける自然な報酬への応答でドーパミンやグルタミン酸の神経伝達を尋問するこのシステムの使用を詳しく説明します。本稿の目的は、性的行動その他の行動および実験パラダイムを調べるため実現の可能性を示すことを目標に、雌ハムスターの中にこの伝達物質の放出を測定するプロセスを詳しく説明することです。
ハムスターが電気化学的録音で使用するための理想的なモデル
歴史的に、ラットとマウスのモデルは、性行動の研究で採用されています。これらの齧歯動物種は耳がぴくぴくを追跡し、最終的にマウント女性7男性を誘惑するホッピング、ダーツなど多数の女性の勧誘行動を含む動的交尾シーケンスに従事します。(膣の浸透の有無にかかわらず) 男性による取付けは続きます、ほんの数秒、アクティブな勧誘行動を再開する前に、数秒間だけ中に女性を彼女の性的行動の姿勢で (前彎と呼ばれる) も行っています。この動作、不動の短い期間と散在している活動の高レベルの構成のパターンは動物の行動の神経伝達を測定する問題です。まず、神経活動とは無関係なアンペロ メトリックの録音で運動の成果物もあります。第二に、歩行が脳の特定領域の特定の神経伝達物質のリリースに関連付けられます。たとえば、ドーパミン放出は、背側と腹側線条体8、の9、マイクロダイアリシス ドーパミン精神刺激を次の測定のための基礎を形作った発見自発運動に結合されて管理10。Mos の女性-典型的な勧誘行動神経伝達の変化を総称して最後だけ性行動の明示的なコンポーネントに帰することは困難、t 齧歯動物の歩行活動の高レベルを含む、10 分性行動テストの大部分によって表されます分です。
女性の性行動の神経化学的プロファイルを分析するには、この演習は、性行動に伴う最小限の自発運動がある種を求めた。ハムスター (ん) の交尾のシーケンスは通常のラット及びマウス11見て勧誘行動の不足のため神経の録音に最適です。結果として、雌ハムスターが入力し、セッション12をテスト 10 分から 9 分の上向きの前弯姿勢を維持します。生体内で女性余分な歩行運動の欠如と男性と性的な相互作用のコンポーネントと関連付けることができる電気化学的録音が得られます。
ハムスター交尾発作
試験室に男性の刺激の動物の紹介の後、男性は最初彼女 (図 2A) をマウントする前に女性の性器調査 (AI) で従事します。マウントする男性に、女性は前弯で彼女は背中のアーチし、取付の男性は彼女の膣への陰茎のアクセスを得ることができますので、彼女の尾を偏向として知られている受容性姿勢を仮定しなければなりません。男性は両方の足 (図 2B) と彼女の後半部を握りしめる女性をマウントし、陰茎あたって (図 2C) を得るために試みに突っ込み始めます。男性は射精を最終的に達成する前に回数を intromit し同様 (挿入) することがなく女性がマウントされます。マウントと射精につながる intromissions のこのシーケンスは、「交尾試合」と呼ばれます。男性は、単一セッション内で複数交尾一続きがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
比較的簡単ですが、この手法を採用する場合にいくつかの問題が発生します。まず、プローブの固定配置が正確でなければならない: マイクロダイアリシス プローブを取り巻く細胞外の環境のより広い半径でサンプルするとは異なりこの手法のみの直接接触に入って来る物質の計測が可能プローブ。第二に、繊維の幅が狭いため、炭素繊維の記録の場合破損が発生することができますと意図?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、Matlab コードを実行している彼のためのダニエルの Korus 学部と学部アレックス ベッチャー行動実験を実行している彼の援助に感謝したいと思います。このプロジェクトは、R.L.M. に NSF IOS 1256799 によって薬物乱用賞番号 T32DA007234 の下で健康の国民の協会の国立研究所でサポートされています。
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
