Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili
Summary
Questa carta dettaglia l’uso di registrazioni di fisso-potenziale amperometrico utilizzando elettrodi in fibra di carbonio e tecnologia dei biosensori enzimatici per misurare il rilascio di dopamina e glutammato con elevata risoluzione temporale durante il naturale comportamento gratificante nella criceto femmina.
Abstract
La capacità di misurare il rilascio di neurotrasmettitore su una scala di tempi rapidi consente modelli della neurotrasmissione per essere collegati a specifici comportamenti o manipolazioni; un potente strumento nel delucidamento sottostanti meccanismi e circuiti. Mentre la tecnica della microdialisi è stata utilizzata per decenni per misurare quasi qualsiasi analita di interesse nel cervello, questa tecnica è limitata nella risoluzione temporale. In alternativa, voltammetria ciclica scansione veloce è sia temporalmente preciso ed estremamente sensibile; Tuttavia, poiché questo metodo tecnicamente difficile si basa sull’electroactivity dell’analita di interesse, è eliminata la possibilità di rilevare sostanze nonelectroactive (ad es., il glutammato, un neurotrasmettitore). Questo documento descrive in dettaglio l’utilizzo di un sistema di chiavi che unisce potenziale fisso amperometria e biosensori enzimatici per misurare sia elettroattivi e nonelectroactive neurotrasmettitori con precisione temporale. L’abbinamento di questi due potenti tecniche consente la misurazione di tonico e fasico neurotrasmissione con relativa facilità e permette di registrare dei neurotrasmettitori multipli contemporaneamente. Lo scopo di questo manoscritto è per illustrare il processo di misurazione della dopamina e glutammato neurotrasmissione in vivo mediante un comportamento naturalmente gratificante (cioè, comportamento sessuale) in criceti femminile, con l’obiettivo finale di visualizzare il fattibilità tecnica di questo test per l’esame di altri comportamenti e paradigmi sperimentali.
Introduction
La capacità di misurare il rilascio di neurotrasmettitori in animali svegli comportamento permette ai ricercatori di collegare comportamenti specifici con i modelli spaziali e temporali di neurotrasmissione-un potente strumento per indagare i meccanismi e circuiteria sottostante sia naturale e comportamenti operanti in tempo reale. Storicamente, il microdialysis è stato impiegato per misurare sostanze sia elettricamente reattivi e non reattivi nell’ambiente extracellulare del cervello1. Questa tecnica utilizza un flusso continuo di una soluzione acquosa di composizione ionica simile al liquido extracellulare, attraverso una sonda di microdialysis composta da un piccolo albero con una punta di una membrana semipermeabile fibra cava2. Dopo l’inserimento della sonda, neurotrasmettitori o altri analiti di interesse possono attraversare la membrana semipermeabile con la diffusione passiva prima di essere raccolti a intervalli per la successiva analisi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), un chimica analitica tecnica comunemente utilizzata per separare, identificare e quantificare i componenti in una miscela eterogenea3.
Anche se il microdialysis è una tecnica sensibile che può essere utilizzata per misurare praticamente qualsiasi analita di interesse, la risoluzione temporale è bassa, con frequenze di campionamento massima dell’ordine di minuti a decine di minuti1,2. L’invenzione della scansione rapida voltammetria ciclica (FSCV), una tecnica che si basa sul potenziale redox di specie elettroattivi, può delucidare vicino istantanee concentrazioni dell’analita di interesse nel liquido extracellulare. In breve (Vedi Robinson et al. 4 per una vasta revisione), un elettrodo è applicato per alzare e abbassare la tensione in una moda onda triangolare su una scala di tempo veloce4. Quando la tensione è nell’intervallo corretto, il composto di interesse ripetutamente è ossidato e ridotto. Questa ossidazione e riduzione si traduce in un movimento di elettroni che crea una piccola corrente alternata. Scansione tariffe avvengono sulla scala di frazioni di secondo con ossidazione e riduzione dei composti che si verificano in microsecondi. Sottraendo lo sfondo corrente creato dalla sonda dalla corrente risultante, uno può generare una tensione vs attuale trama unica per ogni composto. Poiché la scala temporale delle oscillazioni della tensione è conosciuta, questi dati possono essere utilizzati per calcolare un complotto della corrente in funzione del tempo. Così, le concentrazioni relative del composto possono essere determinate, purché il numero di elettroni trasferiti in ogni ossidazione e reazione di riduzione è nota4.
Questa specificità chimica ed elevata risoluzione temporale fare FSCV una potente tecnica per la rilevazione cambiando concentrazioni chimiche in vivo. Tuttavia, nonostante questi molteplici vantaggi, questa tecnica richiede ampie competenze tecniche e attrezzature costose e installazione. Ulteriormente, i neurotrasmettitori nonelectroactive (ad es., glutammato) non possono essere misurati utilizzando questa tecnica. Fortunatamente, i progressi tecnologici nel campo della elettrochimica5, come pure la commercializzazione di queste invenzioni, ha introdotto un approccio relativamente semplice per misurare non-elettroattivi neurotrasmettitori in animali comportamento svegli senza compromettere temporale precisione-una tecnica nota come tecnologia dei biosensori enzimatici. Questa tecnica utilizza la conversione enzimatica del neurotrasmettitore nonelectroactive di interesse nei due substrati, uno dei quali è il perossido di idrogeno elettroattivi viene rilevato come un’ossidazione amperometrici corrente generata da un potenziale applicato5 . Biosensore commercialmente disponibili sonde (vedere Figura 1) selettivamente misurano analiti di interesse competitivo riducendo il contributo di interferenti endogeni. Nel caso di glutammato, il contributo di comune interferent acido ascorbico (AA) competitivo viene ridotto alla corrente misurata di co-localizzazione di ossidasi AA sulla superficie enzimatica attiva del sensore, conversione AA in non-elettroattivi dihydroascorbate e acqua. Inoltre, uno strato di polimero Nafion caricato negativa presente sotto lo strato di enzima esclude composti anionici endogeni.
Questa stessa impostazione sperimentale di biosensore in grado di misurare elettroattivi neurotrasmettitori come in FSCV, ma invece impiega un potenziale fisso registrazione6. In contrasto con la tensione oscillante applicata in FSCV, in una registrazione di potenziale fissa la tensione è mantenuta a redox potenziale per l’analita di interesse. Anche se è meno chimicamente selettivo rispetto FSCV come neurotrasmettitori multipli possono avere la stessa potenziale, redox nelle aree del cervello che schiacciante inclinare verso un neurotrasmettitore, la natura di turno-chiave di questo approccio supera la mancanza di sostanza chimica specificità.
La possibilità di misurare sia elettroattivi e nonelectroactive rilascio di neurotrasmettitori in tempo quasi reale e collegarlo a specifici eventi comportamentali offre l’opportunità di esaminare convergenti del rilascio di neurotrasmettitore. Questo manoscritto descrive in dettaglio l’utilizzo di questo sistema per interrogare la neurotrasmissione del glutammato e della dopamina in risposta alla naturale ricompensa in criceti comportamento svegli. Lo scopo di questa carta è di dettagliare il processo di misurazione questo rilascio di neurotrasmettitore durante il comportamento sessuale nei criceti femminili, con l’obiettivo di dimostrare la fattibilità per l’esame di altri comportamenti e paradigmi sperimentali.
I criceti sono un modello ideale per l’uso in elettrochimiche registrazioni
Storicamente, i modelli del ratto e topi sono stati impiegati nello studio del comportamento sessuale. Queste specie di roditori impegnano in una sequenza dinamica di copula, che coinvolge numerosi comportamenti femminili sollecitazione che includono hopping, guizzanti e orecchio dimenando per attirare il maschio inseguire e infine montare la femmina7. Il montaggio da parte del maschio (con o senza penetrazione vaginale) dura solo pochi secondi, durante il quale la donna si impegna nella sua postura di comportamento sessuale (chiamato lordosi) anche solo per pochi secondi prima di riprendere i comportamenti attivi sollecitazione. Questo modello di comportamento, composto da alti livelli di attività intervallati da brevi periodi di immobilità, è problematico per la misurazione di neurotrasmissione nel comportarsi animali. In primo luogo, possono esserci artefatti di movimento nelle registrazioni amperometrico che non sono correlate all’attività neurale. In secondo luogo, la locomozione è associata con il rilascio di neurotrasmettitori particolare in determinate regioni del cervello. Ad esempio, rilascio della dopamina è stato accoppiato ad attività locomotrice nel corpo striato dorsale e ventrale8,9, trovando quello ha costituito la base per le misurazioni di microdialisi della dopamina seguendo psicostimolante amministrazione10. Perché i comportamenti di donna-tipica sollecitazione a most roditori comportano alti livelli di attività locomotrice e sono rappresentati dalla mole di un test di comportamento sessuale di 10 minuti, questo rende difficile attribuire i cambiamenti nella neurotrasmissione ai componenti esplicite di comportamento sessuale che collettivamente durano solo minuti.
Per analizzare il profilo del neurochemical del comportamento sessuale femminile, questo laboratorio ha cercato una specie in cui c’è minima attività locomotrice che accompagna il comportamento sessuale. La sequenza copulatoria in criceti siriani (Mesocricetus auratus) è ideale per le registrazioni del neurochemical a causa della mancanza di comportamenti di sollecitazione tipicamente osservati in ratti e topi11. Di conseguenza, criceti femminile entrerà e mantenere la postura di lordosi per verso l’alto 9 minuti fuori 10 minuti test sessione12. Con la mancanza di movimenti estranei locomotore dalla femmina, in vivo si ottengono registrazioni elettrochimiche che possono essere associate a componenti di interazioni sessuali con l’uomo.
Bouts copulatoria in criceti
Dopo l’introduzione di un animale maschio stimolo nella camera di prova, l’uomo inizialmente si impegnerà nell’inchiesta anogenital (AI) della femmina prima di montare il suo (Figura 2A). In ordine per il maschio montare, la donna deve assumere un atteggiamento di sessuale ricettivo conosciuto come lordosi, in cui lei inarca la schiena e devia la coda in modo che il maschio di montaggio possa accedere del pene vagina per lei. Il maschio monterà la femmina, stringendo il suoi quarti posteriori con entrambe le zampe (Figura 2B) e iniziare spingendo nel tentativo di guadagnare intromission penile (Figura 2C). Il maschio montare la femmina (senza inserimento) così come cooptare un numero di volte prima di raggiungere alla fine eiaculazione precoce. Questa sequenza di Monti e intromissions che conduce alla eiaculazione è definita un “incontro copulatoria”. I maschi avranno diversi attacchi copulatore all’interno di una singola sessione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se relativamente semplice, alcuni problemi possono sorgere quando si impiegano questa tecnica. In primo luogo, il posizionamento delle sonde stereotassica deve essere preciso: a differenza di microdialysis che campiona un raggio più ampio del milieu extracellulare che circonda la sonda, questa tecnica permette solo la misura di un neurotrasmettitore che entra in contatto diretto con la sonda. In secondo luogo, nel caso la registrazione di fibra di carbonio, a causa della piccola larghezza di fibra, può verificars…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare universitari Daniel Korus per il suo aiuto in esecuzione il codice Matlab e undergraduate Alex Boettcher per la sua assistenza nell’esecuzione di esperimenti comportamentali. Questo progetto è sostenuto da NSF IOS 1256799 a R.L.M. e dall’Istituto nazionale su abuso di droga dei National Institutes of Health, sotto Premio numero T32DA007234.
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
References
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
- Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
- Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
- Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
- Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
- Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
- Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
- Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
- Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
- . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
- Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
- . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
- Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
- Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
- Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
- Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
- Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
- Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
- Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
- Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
- Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
