Måler i Vivo endringer i ekstracellulære nevrotransmittere under naturlig givende atferd i kvinnelige syrer Hamsters

Summary

Dette papiret viser bruk av fast potensial amperometric opptak med karbonfiber elektroder og enzymatiske biosensor teknologi for å måle utgivelsen av dopamin og glutamat med timelige høyoppløselig under naturlige givende atferd i den kvinnelig hamster.

Abstract

Muligheten til å måle nevrotransmitter utgivelse på en rask tidsskala kan mønstre av neurotransmission skal kobles til spesifikk atferd eller manipulasjoner; et kraftig verktøy i Klargjørende underliggende mekanismer og kretser. Mens teknikken av microdialysis har blitt brukt i flere tiår for å måle nesten alle analytt rundt i hjernen, er denne teknikken begrenset i midlertidig løsning. Alternativt, rask skanning syklisk voltammetry er både tidsmessig presis og ekstremt følsom; men fordi denne teknisk vanskelig metoden er avhengig av electroactivity av analytt rundt, er muligheten til å oppdage nonelectroactive stoffer (f.eks, signalstoffet glutamat) eliminert. Dette papiret viser bruk av en nøkkelferdig system som kombinerer fast potensial amperometry og enzymatiske biosensing å måle både electroactive og nonelectroactive nevrotransmittere med timelige presisjon. Sammenkoblingen av disse to kraftige teknikker kan for måling av både tonic og phasic neurotransmission med relativ letthet, og tillater registrering av flere nevrotransmittere samtidig. Målet med dette manuskriptet er å vise prosessen med måler dopamin og glutamat neurotransmission i vivo bruker en naturlig givende atferd (dvs., seksuell atferd) i kvinnelige hamsters, med det endelige mål å vise den teknisk gjennomførbarhet av denne analysen for å undersøke andre atferd og eksperimentelle paradigmer.

Introduction

Muligheten til å måle nevrotransmitter utgivelse i våken oppfører dyr kan forskere koble spesifikk atferd med romlige og tidsmessige mønstre for neurotransmission-en kraftig verktøy for å undersøke mekanismer og krets underliggende både naturlige og operant atferd i sanntid. Historisk har microdialysis vært ansatt å måle både elektrisk reaktive og nonreactive stoffer i ekstracellulære miljøet av hjernen¹. Denne teknikken bruker en kontinuerlig strøm av en vandig løsning av lignende ioniske sammensetning ekstracellulære væsken, gjennom en microdialysis sonde består av en liten aksel med tips av en semipermeable hul fiber membran². Etter innsetting av sonden, nevrotransmittere eller andre analytter rundt kan krysse semipermeable membran med passiv diffusjon før samles i intervaller på påfølgende analyse av høy ytelse flytende kromatografi (HPLC), en analytisk kjemi teknikk vanligvis benyttes separate, identifisere og kvantifisere komponenter i en heterogen blanding³.

Selv om microdialysis er en følsom teknikk som kan brukes til å måle nesten alle analytt rundt, er timelige oppløsningen lave, med maksimal samplingsfrekvenser på minutter titalls minutter^1,2. Oppfinnelsen av rask skanning sykliske voltammetry (FSCV), en teknikk som bruker redoks potensialet av electroactive Art, kan belyse nær øyeblikkelig konsentrasjoner av analytt rundt i ekstracellulære væske. I korte trekk (se Robinson et al. ⁴ for en omfattende gjennomgang), en elektrode brukes til å heve og senke spenningen i en trekantet bølge mote på raske tid skala⁴. Når spenningen er i riktig område, er sammensatt av interesse gjentatte ganger oksidert og redusert. Dette oksidering og reduksjon resulterer i en bevegelse av elektroner som skaper en liten vekselstrøm. Skanne priser finner sted på sub-sekunders skala med oksidering og reduksjon av forbindelser forekommer i mikrosekunder. Ved å trekke bakgrunnen gjeldende opprettet av sonden fra resulterende gjeldende, kan man generere en spenning vs gjeldende tomten unike for hver sammensatte. Siden tidsskalaen i spenning svingninger er kjent, kan disse dataene brukes til å beregne en tomt på gjeldende som en funksjon av tid. Dermed bestemmes relative konsentrasjonen av sammensatte antall elektroner overført i hver oksidering og reduksjon reaksjon er kjent⁴.

Denne kjemiske spesifisitet og tidsmessige høyoppløselig gjør FSCV en kraftig teknikk for å oppdage endrer kjemiske konsentrasjoner i vivo. Men til tross for disse mangfoldige fordelene krever denne teknikken omfattende tekniske ekspertise og dyrt utstyr og oppsett. Videre ikke kan nonelectroactive nevrotransmittere (f.eks, glutamat) måles ved hjelp av denne teknikken. Heldigvis teknologiske fremskritt innen elektrokjemi⁵, i tillegg til kommersialisering av disse oppfinnelser, har introdusert en relativt enkel tilnærming til å måle ikke-electroactive nevrotransmittere i våken oppfører dyr uten akkord timelige presisjon-en teknikk kjent som enzymatisk biosensor teknologi. Denne teknikken bruker enzymatisk konvertering av nonelectroactive nevrotransmitter rundt i to underlag, hvorav ett er electroactive hydrogenperoksid som gjenkjennes som en amperometric oksidasjon gjeldende generert av en anvendt potensial⁵ . Tilsvarede biosensor sonder måle (se figur 1) selektivt analytter rundt konkurransedyktig reduserer bidrag av endogene interferents. I tilfelle av glutamat reduseres bidrag av den felles interferent askorbinsyre (AA) konkurransedyktig til målt gjeldende co lokalisere AA oksidase på aktive enzymatisk overflaten av sensoren, konvertere AA til ikke-electroactive dihydroascorbate og vann. I tillegg ekskluderer et negativt ladde Nafion polymer lag tilstede under enzym laget endogene anionic forbindelser.

Denne samme biosensor eksperimentelle oppsett kan måle electroactive signalstoffer som FSCV, men i stedet den benytter en fast potensial opptak⁶. I motsetning til oscillerende spenningen brukt i FSCV, i en fast potensial innspilling holdes spenningen på av redoks potensial for analytt rundt. Selv om det er mindre kjemisk selektiv enn FSCV som flere nevrotransmittere kan ha den samme redoks potensial, i hjernen områder som overveldende skew mot en nevrotransmitter, oppveier nøkkelferdige natur denne tilnærmingen mangel på kjemisk spesifisitet.

Muligheten til å måle både electroactive og nonelectroactive nevrotransmitter utgivelse i nær sanntid og koble den til spesifikke atferdsmessige hendelser gir en mulighet til å undersøke konvergerende nevrotransmitter-løslate. Dette manuskriptet detaljer bruken av dette systemet kontrollerer både dopamin og glutamat neurotransmission svar på naturlige belønning i våken oppfører hamstere. Målet med denne utredningen er å detalj prosessen med måler denne nevrotransmitter-løslate under seksuell atferd i kvinnelige hamsters, med mål å demonstrere sin mulighetsstudie for å undersøke andre atferd og eksperimentelle paradigmer.

Hamsters er en ideell modell for bruk i elektrokjemiske innspillinger
Historisk har rotte og mus modeller vært ansatt i studiet av seksuell atferd. Disse gnagerarter engasjere seg i en dynamisk copulatory rekkefølge, med mange kvinnelige oppfordring atferd som hopper, darting og øret wiggling å lokke mann jage og til slutt mount kvinnelige⁷. Montering av mannlige (med eller uten vaginal penetrasjon) varer bare noen få sekunder, hvor kvinnelige engasjerer i henne seksuell atferd holdning (kalt lordosis) også bare for et par sekunder før gjenoppta aktive oppfordring atferd. Dette mønsteret av atferd, består av høye nivåer av aktivitet ispedd korte perioder av ubevegelighet, er problematisk for å måle neurotransmission i oppføre dyr. Først, kan det være bevegelse gjenstander i amperometric opptak som er relatert til nevrale aktivitet. Andre er bevegelse knyttet til utgivelsen av bestemt nevrotransmittere i visse områder av hjernen. For eksempel har dopamin utgivelsen vært kombinert locomotor aktivitet i rygg- og ventrale striatum^8,9, et funn som dannet grunnlaget for microdialysis målinger av dopamin etter psykostimulerende administrasjon¹⁰. Fordi den kvinnelige-typiske oppfordring atferd i most gnagere involverer høye nivåer av locomotor aktivitet, og representeres av mesteparten av en 10 minutters seksuell atferd, dette gjør det vanskelig å tilskrive endringer i neurotransmission til eksplisitt komponentene i seksuell oppførsel som kollektivt bare varer minutter.

Analysere nevrokjemiske profilen til kvinnelige seksuell atferd, oppsøkte denne lab Art der det er minimal locomotor aktivitet følger seksuell atferd. Den copulatory sekvensen i syrer hamsters (Mesocricetus auratus) er ideell for nevrokjemiske opptak skyldes mangel på oppfordring oppførsel vanligvis sett i rotter og mus¹¹. Som en konsekvens, vil kvinnelige hamstere legge inn og vedlikeholde lordosis stilling i overkant minutter av en 10-minutters testing økt¹². Med mangel på uvedkommende locomotor bevegelser av kvinner, i vivo fås elektrokjemiske innspillinger som kan knyttes til komponenter av seksuell interaksjon med mannlige.

Copulatory utbrudd i hamstere
Etter innføringen av mannlige stimulans dyr i testing kammeret, vil mannlige utgangspunktet engasjere seg i anogenital undersøkelser (AI) av kvinnelige før montering hennes (figur 2A). For at den mannlige montere, må kvinnelige anta en lyttende seksuell holdning kalles lordosis, der hun buer hun tilbake og deflects henne hale slik at montering mannlige får penile tilgang til hennes vagina. Mannlige vil montere den kvinnelige, slår henne bakfjerding med begge to paws (figur 2B), og begynne stakk i et forsøk på å få penile intromission (figur 2C). Mannlige vil montere kvinnelige (uten innsettingspunkt) samt intromit flere ganger før slutt å oppnå utløsning. Denne aktivitetssekvensen monterer og intromissions fører til utløsning kalles “copulatory bout”. Menn vil ha flere copulatory anfall innenfor en enkeltøkt.

Protocol

alle prosedyrene som er beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Minnesota, og er i samsvar med The Guide og bruk av forsøksdyr 13 . 1. dyr og Cannulation kirurgi motta syriske hamsters fra en vanlig dyr leverandør på ca 55 dager gammel. Merk: Selv om en alder av dyr vil variere på grunn av begrensninger av ulike eksperimentelle paradigmer, for seksuell atferd er det viktig å få se…

Representative Results

Bruker den elektrokjemiske og atferdsmessige koding metodikk beskrevet ovenfor, har dette laboratoriet begynt å karakterisere både tonic og phasic svingninger i både dopamin og glutamat under i vivo opptak av seksuell atferd. På grunn av tidsmessig presis måte av denne metoden, kan vi mer nøyaktig karakterisere neurotransmission under seksuell oppførsel; samt tillegge bestemte endringer i utgivelsen mønstre tilsvarende tonic endringer under parring utbrudd, og tilsvarende…

Discussion

Selv om det er relativt enkelt, kan noen problemer oppstå når ansette denne teknikken. Først stereotaxic plasseringen av sonder må være nøyaktig: i motsetning til microdialysis som en større radius av ekstracellulære miljøet rundt sonden, denne teknikken kan bare måling av en nevrotransmitter som kommer i direkte kontakt med sonde. Andre, i karbonfiber opptaket, på grunn av liten bredden av fiber, brudd kan oppstå, og proben må settes inn med bevisst omsorg. Ved glutamatergic biosensors, kan enzymatisk degra…

Materials

Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free–available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.