Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. Individuelle Thalamocortical Axone und ihre präsynaptischen Terminals werden durch eine einzelne Zelle Elektroporation Technik mit DsRed und GFP-Tags Synaptophysin visualisiert.
Abstract
Axon verzweigen und Synapse Bildung sind entscheidende Prozesse für die Festlegung der genauen neuronale Schaltkreise. Während der Entwicklung bilden sensorische Thalamocortical (TC) Axone Zweige und Synapsen in bestimmten Schichten der Großhirnrinde. Trotz der offensichtlichen räumliche Korrelation zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung ist die kausale Beziehung zwischen ihnen kaum verstanden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir vor kurzem eine Methode für die gleichzeitige Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in organotypischen Kokulturen entwickelt.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode besteht aus einer Kombination von organotypischen Coculture und Elektroporation. Organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde erleichtern, Genmanipulation und Beobachtung der axonalen Prozesse, Erhaltung der charakteristischen Strukturen wie laminar Konfiguration. Zwei unterschiedliche Plasmide Codierung DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) wurden Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation-Technik. Diese Methode erlaubt uns, individuelle axonalen Morphologien von TC Neuronen und ihren präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren. Die Methode aktiviert auch Langzeit-Beobachtung, der den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung offenbart.
Introduction
Die Thalamocortical (TC) Projektion in das Gehirn von Säugetieren ist ein geeignetes System, Axon Guidance und targeting Mechanismen zu untersuchen. Während der Entwicklung wachsen sensorische TC Axone in die kortikale Platte und Form Zweige und Synapsen bevorzugt in Schicht IV der primären sensorischen Bereiche in der Großhirnrinde1,2. Auch nach Gründung der grundlegenden Verbindungen sind abhängig von Veränderungen der Umwelt3,4axonalen Lauben und synaptischen Terminals umgebaut. Jedoch wie TC Axon Morphologie dynamisch geändert ist schlecht verstanden. Einer der Hauptgründe ist das Fehlen einer angemessenen Technik, strukturelle Veränderungen auf eine einzelne Zellenebene zu beobachten. Obwohl jüngste Entwicklungen in der Mikroskopie, wie zwei-Photonen-Mikroskopie, direkten Beobachtung von lebenden kortikale Neuronen in Vivoerlaubt haben, gibt es noch technische Einschränkungen für die Erfassung der gesamten TC Trajektorien5, 6. daher, in-vitro- Methoden für live Aufnahmen von TC Axone böte leistungsstarke Tools für Strukturanalysen der Axon verzweigen und Synapse Formation.
Unsere Gruppe zum ersten Mal gegründet eine statische Slice-Kultur-Methode mit durchlässige Membran7. Mit dieser Methode eine Ratte kortikalen Scheibe war mit einem sensorischen Thalamische Block cocultured und Lamina-spezifische TC Verbindungen wurden in diesem organotypischen Kokulturen7,8zusammengefaßt. Spärliche Beschriftung mit einem fluoreszierenden Protein weiter konnten wir beobachten, TC Axon Wachstum und Zweig Bildung9,10,11. Vor kurzem haben wir eine neuartige Methode zur gleichzeitigen Darstellung von Verzweigungen und Synapse Bildung von individuellen TC Axone in die organotypischen cocultures12. Um TC Axone und präsynaptischen Websites gleichzeitig visualisieren, waren DsRed und Verschlagwortet mit EGFP Synaptophysin (SYP-EGFP) Co transfizierten in eine kleine Anzahl von Thalamische Neurone durch Elektroporation organotypischen Coculture. Die aktuelle Methode morphologische Analyse des TC Axone erleichtert und ermöglicht eine langfristige Beobachtung, die verwendet werden können, um den ursächlichen Zusammenhang zwischen Axon verzweigen und Synapse Bildung zu zeigen.
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Protocol
Alle Versuche wurden nach den Richtlinien festgelegten Tierschutz Ausschüsse von Universität von Osaka und Japan Neurowissenschaftliche Gesellschaft durchgeführt.
(1) organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde
Hinweis: Die detaillierte Vorgehensweise finden Sie in der ursprünglichen Publikationen7,8,13. Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Sprague-Dawley (SD) Ratten werden für neuronale Kulturen verwendet.
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Vorbereitung der Reagenzien
Hinweis: Bände der folgenden Reagenzien sind für eine Rattengehirn.- Vorbereitung 10 x modifizierte N2-Ergänzung 13: Insulin (50 μg/mL), Progesteron (200 nM), Hydrocortison (200 nM), Natriumselenit (300 nM), Transferrin (1 mg/mL), Putrescin (1 mM), Glukose (60 mg/mL)
- Prepare Serum-haltigen Kulturmedium (10 mL): 85 % DMEM/F12, 10 X geändert N2 Zuschlag von 10 %, 5 % fetalen bovine Serum (FBS)
- Prepare serumfreien Kulturmedium (20 mL): 90 % DMEM/F12, 10 X geändert N2 Zuschlag von 10 %
- Bereiten Sie Ratte Schweif Kollagen Lösung (0,5 mL). In Kürze nehmen zartere Fasern aus einem Rattenschwanz unter sterilen Bedingungen und brüten in Essigsäure-Lösung über Nacht. Nach Zentrifugation den überstand (ein paar mg/mL) erheben und speichern in einem Kühlschrank-13.
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Zubereitung von Speisen Kultur
- Legen Sie einen Membran-Einsatz in einer 35 mm Petrischale.
- Die Membran 40-50 μL der Ratte Schweif Kollagen-Lösung hinzu, und verbreiten Sie die Kollagen-Lösung um das Zentrum herum zu.
- Die Membran vollständig in einer sauberen Werkbank der Luft trocknen lassen.
- Setzen Sie 1,5-2 mL Serum-haltigen Kulturmedium in die Schüssel, so dass die Membran mit dem Medium getränkt ist.
- Legen Sie die Kulturschale in einem Inkubator (37 ° C, feuchte Luft von 95 % und 5 % CO2) vor der Beschichtung.
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Vorbereitung der kortikalen Scheiben
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 % igem Ethanol für 10 min oder länger.
- Sezieren das ganze Gehirn schnell von einem postnatalen Tag (P) 2 Ratte eiskalte Narkose (mitten in der Eis-Chips für ein paar Minuten).
- Ort des Gehirns in eine 100 mm Petrischale mit 100 mL kaltem Hanks ausgewogen Salzlösung.
- Die Pia Angelegenheit aus dem Gehirn zu entfernen, mit feinen Zangen und kortikale Scheiben (300-400 μm Dicke) aus der visuellen und somatosensorischen Kortex mit mikrochirurgischen Schere schneiden (für Details siehe Abbildung 1).
Hinweis: Die Dicke der kortikalen Scheiben wird durch das Ausmaß der Netze unter einem Binokular grob geschätzt.
Hinweis: Alternativ können kortikale Scheiben mit einem Vibratome unter sterilen Bedingungen erfolgen. - Ein paar kortikale Scheiben auf die Membran-Einlage mit einer Einweg-Kunststoff-Pipette zu übertragen.
- Stellen Sie die Positionen der Scheiben in der Mitte des Kultur-Einsatzes mit einer feuerpolierte Pasteurpipette (für Details, siehe8,13) und entfernen Sie überschüssiges Mittel aus dem einfügen.
Hinweis: Der Pegel des Mediums etwas unterhalb der Oberfläche der Scheiben, so dass die Scheiben eine ausreichende Versorgung mit Gas und Medium erhalten können. Dies ist entscheidend für die Zellviabilität. - Pflegen Sie die Scheiben in der Serum-haltigen Nährmedium bei 37 ° C in einem Umfeld von befeuchtete 95 % Luft und 5 % CO2und Kultur allein für einen Tag, bevor ein Thalamische Block genommen und daneben platziert.
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Vorbereitung der Thalamische Blöcke
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70 % igem Ethanol für 10 min oder länger.
- Eine schwangere Ratte (embryonale 15.Tag) durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg/kg), enthält Betäubungsmittel zu betäuben.
- Sezieren Sie jedes Embryo aus den uterinen Hörnern zu, und legen Sie die Embryonen in einem 100 mm Petrischale mit 100 mL kaltem Hanks ausgeglichene Salzlösung.
- Unter einem Binokular das Gehirn von jedem Embryo und schneiden Sie Thalamische Blöcke enthalten vor allem die Ventrobasal komplex und seitlichen gekniet Kern (ca. 0,5 mm x 3)7 mit mikrochirurgischen Schere (siehe Abbildung 1).
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Kultur und pflegen organotypischen Kokulturen
- Mit einer Pasteurpipette, legen Sie die Thalamische Block neben der ventrikulären Oberfläche der kortikalen Schicht auf die Membranfilter erteilte.
- Pflegen Sie die Kokulturen in das Serum-haltigen Nährmedium bei 37 ° C in einem Umfeld von befeuchtete Luft von 95 % und 5 % CO2.
- Tauschen Sie die Hälfte des Mediums mit dem Kulturmedium serumfreien nach zwei Tagen in der Kultur. Danach tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage.
Hinweis: Das Niveau des Mediums sollte nach den Datenträgeraustausch überprüft werden, da es wichtig für das Überleben der Zelle.
(2) Elektroporation
Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
Hinweis: Führen Sie durch Elektroporation einen Tag nach der Vorbereitung der Thalamische Blöcke, Ablösung der Blöcke zu verhindern.
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Plasmide
- Machen Sie eine Mischung aus Plasmide wie folgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
Hinweis: Die beiden Plasmide mit einem Endotoxin-freie Maxiprep-Kit zu reinigen und in Hanks ausgeglichene Salzlösung auflösen.
- Machen Sie eine Mischung aus Plasmide wie folgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
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Elektroporation Gerät einrichten
Die elektrischen Instrumente wie ein Stimulator und ein Isolator sollte angeschlossen werden, wie in Abbildung 2dargestellt.- Verbinden Sie den Stimulator mit biphasischen Isolator.
- Verbinden Sie eine Elektrode (ein Silberdraht 0,2 mm Durchmesser) mit dem Minuspol des Isolators.
- Eine Elektrode (ein Silberdraht 1 mm Durchmesser) in Reihe zu einem 100 Ω Widerstand und der Pluspol des Isolators anschließen.
- Verbinden Sie den Verstärker mit dem Oszilloskop zu überwachen, ob elektrische Ströme über den Widerstand übergeben werden, durch die Messung der Spannung mit dem Verstärker.
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Vorbereitung von Glaspipetten
Hinweis: Zwei Arten von Glaspipetten Auswurf der Plasmid-Lösung und Anwendung elektrischer Impulse dienen.- Machen Sie die Pipetten von Glaskapillaren mit einer Elektrode Abzieher.
- Die Tipp für die Auswurf-Pipette (der Kopfkreis sollte 20-50 μm) zu brechen.
- Schleifen Sie und Polieren Sie der Elektrode Pipettenspitze mit Sandpapier gefolgt von Feuer-polieren (der innere Durchmesser sollte 50-200 µm).
Hinweis: Die Elektrodenspitze sollte flach und glatt, wie es das Gewebe direkt berührt.
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Verfahren der Elektroporation
- Verbinden Sie die Auswurf und Elektrode Pipetten mit der Manipulatoren.
- Legen Sie ein Silberdraht (0,2 mm Durchmesser) in die Elektrode Pipette.
- Legen Sie die Auswurf-Pipette auf eine 1 mL Spritze mit einem Kunststoffrohr.
- Nehmen Sie > 5 μl Plasmid-Lösung in die Auswurf-Pipette durch Spritze absaugen.
- Legen Sie die Coculture auf der Bühne Elektroporation, und legen Sie die 1 mm Durchmesser Elektrode in das Kulturmedium.
- Legen Sie die Auswurf-Pipette auf die Thalamische Explant.
- Schieben Sie die Spritze manuell, nachdem die Spitze die Oberfläche des Thalamische Blocks berührt.
Hinweis: Über 0,5 μL des Plasmids wird die Lösung in der Regel pro Thalamische blockweise eingesetzt. - Legen Sie die Elektrode Pipette auf Thalamische Block unmittelbar nach der Rücknahme der Auswurf Pipette.
- Elektrische Impulse (50-400 μA, 3 bis 5 Züge der 200 Quadratmeter Impulse von 1 ms Dauer bei 200 Hz) zu liefern. Die Amplitude und die Anzahl der Züge auf dem Oszilloskop zu überwachen.
Hinweis: Die Amplitude der elektrischen Ströme hängt von der Innendurchmesser eine Elektrode Pipette13. - Die Elektrode Pipette zurückziehen und das Gericht in den Inkubator zurück.
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Mikroskopische Beobachtung
- Setzen der Kulturschale auf einer mikroskopischen Bühne eine aufrechte confocal Mikroskop, ausgestattet mit zwei Filter-Sets für EGFP (Erregung, 488 nm, Emission, 515 nm) und DsRed (Erregung, 514 nm, Emission, 565 nm).
- Nehmen Sie Bilder von 10-25 optischen Abschnitte am 1-7 µm-Schrittweiten mit einem 20 X lange arbeitende Abstand Objektiv. Wählen Sie individuell unterscheidbar beschrifteten Axone die DsRed und SYP-EGFP ausdrücken.
Hinweis: Die beobachteten Bereich ist ca. 0,7 x 0,7 mm (entspricht 1024 x 1024 Pixel, d. h., 0,68 μm/Pixel). - Die Aufnahmen Sie alle 24 h für die tägliche Bildgebung. Innerhalb von 10 min bei Raumtemperatur, und schicken Sie die Kulturen in den Inkubator. Halten Sie für kurz-Intervallzeit Zeitraffer Bildgebung die Kultur in einer Kultur-Kammer, die behauptet, dass die Umwelt von 95 % Luft und 5 % CO2 bei 37 ° c befeuchtet
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Representative Results
Das Experiment beschriebenen hier zielt darauf ab, die Beziehung zwischen TC Axon verzweigen und Synapse Bildung zu offenbaren. Um gleichzeitig visualisieren axonalen Flugbahnen und Standorte der präsynaptischen Seiten, einzelne oder wenige Thalamische Zellen in organotypischen Kokulturen wurden mit zwei Plasmide Codierung SYP-EGFP und DsRed mit Elektroporation transfiziert. In der zweiten Woche in Kultur wurden individuell unterscheidbar TC Axone durch DsRed (Abbildung 3) eindeutig gekennzeichnet. Nur die Axone, die DsRed und SYP-EGFP ausgestellt wurden zur Beobachtung ausgewählt. Beschriftete TC Axone das kortikale Slice überfallen und Zweige gebildet, vor allem in den oberen Schichten, darauf hinweist, dass Thalamische Axone in die organotypischen cocultures Form Zweige mit laminarer Spezifität ähnelt, die in Vivo7, gefunden 8,10,14,15,16,17. Zur gleichen Zeit konnte punctata Aggregationen von SYP-EGFP (SYP-EGFP Puncta) entlang DsRed beschriftet TC Axone (Abbildung 3-D-3F) beobachtet werden. Da diese SYP-EGFP Puncta waren meist colocalized mit Immunopositive Signale für VGLUT2, die präsynaptischen Marker für Thalamische Zellen, und PSD95, die eine allgemeine postsynaptischen Marker ist, ist es wahrscheinlich dass SYP-EGFP Puncta meist präsynaptischen darstellen Seiten im TC Axone12.
Time-Lapse Bildgebung des TC Axone weiter zeigte, dass Axon Verzweigung und Synapse Bildung von Thalamische Neurone wurden kontinuierlich und dynamisch mit Addition und Eliminierung (Abbildung 4)12. Darüber hinaus fanden die meisten Niederlassungen entstehen aus SYP-EGFP Puncta, darauf hinweist, dass präsynaptischen Websites Zweig Bildung (für Details, siehe12) auslösen.
Abbildung 1 . Das Verfahren zur Vorbereitung einer organotypischen Kokulturen des Thalamus und Großhirnrinde. (A) die Draufsicht des Neugeborenen Rattengehirn. Der erste Schnitt erfolgt parallel zur Mittellinie (1). Dann sind 300 - 500 μm dicken koronalen Abschnitte aus der primären visuellen und somatosensorischen Cortex (2) schneiden. Stellen Sie abschließend eine parasagittalen geschnitten, um die kortikalen Scheiben (3) zu erhalten. (B) eine schematische Darstellung einer organotypischen Coculture des Thalamus und Großhirnrinde. Kortikale Scheiben aus postnatale 2.Tag Ratte und Thalamische Blöcke aus embryonalen 15.Tag sind auf Membranfilter cocultured. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Eine schematische Darstellung von elektrischen Instrumenten für die Elektroporation. Der Stimulator, der Isolator und die Elektrode Pipette sind in Reihe geschaltet. Negativ geladenen DNA zu liefern, ist die Elektrode Pipette mit dem Minuspol des Isolators verbunden. Die elektrischen Ströme für die Elektroporation können mit dem Oszilloskop überwacht werden. TH: Thalamus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Thalamocortical Axone in eine Coculture nach 2 Wochen in der Kultur. (A–F) Coexpression von SYP-EGFP mit DsRed in einem Axon Thalamocortical (TC). DsRed plus SYP-EGFP Plasmide worden in kultivierten Thalamische Zellen an 1 Tag in Vitro (DIV) mit Elektroporation eingeführt. (A) eine organotypischen Coculture Thalamische und kortikalen Scheiben nach 12 DIV. (B) mit der Bezeichnung von A DsRed Thalamische Zelle erstreckt sich ein Axon in der kortikalen Slice und Zweige in den oberen Schichten bildet. (C) ein vergrößertes Bild die boxed Region in (A). (D-F) zeigen die DsRed beschriftet TC Axon (D) und SYP-EGFP Puncta (E) in die boxed Region (c). Diskrete Anhäufung von SYP-EGFP wurde entlang einer einzigen TC Axon beobachtet. TH: Thalamus. Skalieren Sie Bars: (B) 1 mm, (C) 100 µm und (F) 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Zeitraffer Bildgebung ein Thalamocortical Axon Ausdruck SYP-EGFP und DsRed in einem organotypischen Coculture. In kultivierten Thalamische Zellen in 1 DIV mit Elektroporation DsRed plus SYP-EGFP Plasmide eingeführt. Dieses Axon abgebildet wurde täglich über 4 Tage (11 DIV 14 DIV). Maßstabsleiste: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Das aktuelle Protokoll ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, Entwicklungsaspekte der wachsenden Axone anders als der TC Projektion11zu studieren. Zum Beispiel ermöglicht eine Kombination der kortikalen Stück Kultur und die Elektroporation Technik Visualisierung einzelner axonalen Morphologie der kortikalen Neuronen und langfristige Beobachtung9,18.
Mithilfe des aktuellen Protokolls können die Rollen von interessanten Genen in Axon verzweigen und Synapse Bildung auch durch Co Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen und Interesse-Gene analysiert werden. In der Regel sind mehr als 90 % der fluoreszierenden Proteins mit dem Ausdruck ihrer Zellen mit einem zweiten Plasmid Co transfiziert wenn das molare Verhältnis von Plasmid-Lösungen bis 1:218,19angepasst wird. Jedoch das optimale Verhältnis möglicherweise anders als Co-Transfektion Wirksamkeit und Ausdruck sind unter Vektoren lagen.
Obwohl das aktuelle Protokoll für Zeitraffer Experimente effizient ist, gibt es einige technische Probleme. Für die tägliche Bildgebung wurde ein Coculture auf einer mikroskopischen Bühne jeden Tag gelegt. Obwohl axonalen Entwicklung nicht offenbar täglich bildgebenden10ernsthaft betroffen sind, sollte jede Beobachtung innerhalb von 10 min bis zum Verdampfen des Kulturlösung und Veränderung des pH-Wertes des Kulturmediums zu minimieren abgeschlossen sein. Alternativ wäre es besser, Temperatur-, Feuchtigkeits- und pH-Wert der Kulturen auf der mikroskopischen Stufe12zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken auch Gabriel Hand für kritisches Lesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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