Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

Published: March 21, 2018 doi: 10.3791/56943
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,3
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

Summary

קבלת דנ א גנומי באיכות גבוהה רקמות הגידול, מהווה צעד ראשון חיוני לניתוח שינויים גנטיים באמצעות רצף הדור הבא. במאמר זה, נציג שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג שלמות הדנ א של מגע ההטבעה ציטולוגיה דגימות ולהעשיר תאים סרטניים.

Abstract

זה חיוני כדי לקבוע את מצב mutational בסרטן לפני ניהול וטיפול בתרופות ספציפיות יישוב מולקולרית לחולי סרטן. בהגדרה קלינית, פורמלין-תיקון רקמות (FFPE) פרפין-מוטבע נמצאים בשימוש נרחב עבור בדיקה גנטית. עם זאת, FFPE DNA בדרך כלל פגום, מקוטעת במהלך תהליך פיקסציה עם פורמלין. לכן, FFPE DNA היא לפעמים לא נאותה בדיקות גנטיות עקב איכות נמוכה והן את כמות ה-DNA. כאן אנו מציגים שיטת מגע ההטבעה ציטולוגיה (טיק) להשיג DNA גנומי תאים סרטניים, אשר יכול להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ. מספרי הטלפון הנייד מורפולוגיה, סרטן תאים שניתן להעריך באמצעות דגימות טיק. יתר על כן, הפקת דנ א גנומי מדגימות טיק יכולה להסתיים בתוך יומיים. הסכום הכולל ואיכות DNA טיק שהושג באמצעות שיטה זו הייתה גבוהה יותר מזו של ה-DNA FFPE. שיטה זו מהירה ופשוטה מאפשרת לחוקרים להשיג DNA באיכות גבוהה עבור בדיקות גנטיות (למשלניתוח רצף של הדור הבא, ה-PCR דיגיטלי, בזמן אמת כמותיים PCR), כדי לקצר את משך העבודה על דיווח תוצאות.

Introduction

הדור הבא רצפי טכנולוגיה סיפקה החוקרים התקדמות משמעותית ניתוח הגנום מידע וריאציות גנטיות, מחלות Mendelian, נטייה תורשתית ו סרטן 1,2,3 . סרטן הגנום אטלס (TCGA) של קונסורציום גנום הסרטן הבינלאומי (ICGC) רדף את הזיהוי של שינויים גנטיים של מספר סוגי סרטן נפוצים4. מאות סרטן חיוני הנהג גנים זוהו בהצלחה ולאחר כמה מולקולות אלה מיועדים עבור סמים פיתוח1,5,6.

בהגדרה קלינית, דגימות FFPE משמשים אבחנה פתולוגית ולבדיקה מולקולריות למחלות שונות, כולל סרטן. אולם, במהלך תהליך פיקסציה עם פורמלין, חלבון-דנ א או DNA-DNA cross-linking מתרחש, פיצול הדנ א הוא המושרה. לפיכך, דגימות די אן איי FFPE אינם תמיד מתאימים לבדיקה גנטית עקב איכות נמוכה והן את כמות ה-DNA-7,-8,-9. בנוסף, לוקח מספר ימים כדי להכין דגימות FFPE, מיומנות טכנית יש צורך להכין במדויק את הסעיפים. לכן, רצוי לפתח שיטה פשוטה ומהירה להשגת DNA ללא פגע באיכות גבוהה.

ציטולוגיה היא שיטה אלטרנטיבית לאבחון פתולוגי. הכנת הדוגמא cytological הוא פשוט יותר, פחות גישה יקר, מהירה יותר לעומת הכנה FFPE10. הטכניקה טיק בוצע נטור הלימפה וברקמות שולית של חולי סרטן השד לאבחון מהיר פוסט11,כמה שנים12. עם זאת, ישנם דיווחים מעטים יש בחן אם הדנ א הגנומי באיכות גבוהה יכול להיות מופק דגימות טיק, ומשמש לצורך ניתוח גנטי מאוחר יותר. דגימות cytological בדרך כלל מוכתמים פאפאניקולאו (Pap) או צביעת Giemsa ולאחר בעבר דיווחנו כי כמות ואיכות DNA מופק טיק דגימות (במיוחד שהוכתמו Giemsa דגימות) נעלים על דגימות המתקבל FFPE רקמות13. לעומת Pap מכתים, צביעת Giemsa יש יתרון שאינו דורש פחות הליכים מוכתמים. ב- Pap מכתים, לאחר הדגימות קבוע, צבעונית, הם חייב להיות מותקן עם הרכבה בינונית (למשל, Malinol) להבחנה בין דגימת תוכן, כגון תאים סרטניים, תאים נורמליים ותאים דלקתיים תחת מיקרוסקופ. אם הדגימה Pap מוכן ללא השלב הרכבה, זה כמעט בלתי אפשרי לקיים את התאים במיקרוסקופ כי הדגימה הוא מיובש. לשם השוואה, צביעת Giemsa יכול להיות שנצפו במדינה מיובשים, לכן, הצעד הרכבה אינו נחוץ לצורך הערכה סלולרית מהירה. עבור microdissection, צביעת Giemsa הוא מתאים יותר כי זה דורש דגימות יבש.

בדו ח זה, אנו להציג שיטה פשוטה ומהירה להכנת דגימות טיק עם צביעת Giemsa, להדגים כי טיק הוא מקור טוב יותר עבור ה-DNA לעומת דגימות FFPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיק הכנה מהירה הערכת מיקרוסקופיים באמצעות זכוכית רגילה מחליק

  1. בצע טיק ההכנה בהקדם האפשרי לאחר רקמת פתולוגיים קליניים חומרים זמינים. אם מיד אין אפשרות להכין דגימות טיק, שומרים שהחומרים רקמות מכוסה עם תמיסת מלח לחלח גזה סטרילית ולאחסן במקרר כדי למנוע התייבשות של רקמות.
  2. להכין 5 מ מ3 רקמות חומר כגון גידולים מוצקים (כגוןהכבד, הריאות, רקמות השד) מתקבל קלינית על ידי ניתוח או אנדוסקופיה.
    1. לנגב את הרקמה עם גזה סטרילית מצופה עם תמיסת מלח פיזיולוגית ולהסיר בעדינות דם, אם השטח רקמות יש הרבה דם.
    2. עבור דגימות מיקרוסקופיים כגון ביופסיה חומר, לשמור את הדגימה לחלח עם גזה סטרילית טבולים תמיסת מלח פיזיולוגית.
  3. לחתוך לחתוך את הרקמות עם סכין חיתוך, לחשוף את פני השטח של הנגע הגידול, אם ההמונים גידול אינם גלויים בגסות.
  4. לגעת השטח הגידול של דגימות resected לשקופית זכוכית רגילה מספר פעמים עם ידיים בכפפות. באופן חזותי אשר שלאזור נגע היא מעל 80% של השקופית זכוכית רגילה.
  5. בקלילות לחצו על השקופית זכוכית רגילה נגד naphthalate פוליאתילן (עט) שקופית ממברנה, לשפשף בעדינות 2 - 3 פעמים עם ידיים בכפפות. באופן חזותי אשר שהתאים מועברים משקופית זכוכית רגילה השקופית ממברנה עט.
  6. מילה נהדרת של זכוכית וגם עט ממברנה שקופיות עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. כתם על השקופית זכוכית רגילה לבדיקה cytological ישירה. טובלים בשקופיות זכוכית עם מקבע פתרון עבור 5 s ולאחר מכן הכתם עם Giemsa מכתים פתרון עבור 15 s.
  8. להעריך לבין מסך את הגידול התכנים ואת cellularity על השקופית זכוכית רגילה לחלוטין עם מיקרוסקופ להערכה מהירה. להעריך את תאי הגידול מבוסס על מספר קריטריונים; הגדלת גרעיני קריוטיפ נורמלי, כרומטין שופע, חלוקה לא שווה של תאים, יחס של רכיב רכיב/cytoplasmic גרעינית, גודל תא תא קוטביות.

2. הכנה של הסרט שקופיות ממברנה עט בדיקות סקר גנטיות

  1. אם המדגם מציגה גידול cellularity למעלה מ-60% על ידי הערכה מהירה מיקרוסקופיים (שלב 1.8), נחתך הסרט הגידול-נגע של השקופיות ממברנה עט להפקת DNA, בכפפה ידיים. להעביר את הסרט לחתוך צינור microcentrifuge סטרילי עם pincette והידיים בכפפות.
  2. אם cellularity הגידול נקבע כ נמוך (פחות מ- 60% של התכנים הגידול) ע י הערכה מהירה מיקרוסקופיים (שלב 1.8), לייזר לשימוש ללכוד את microdissection, להשיג דגימות הגידול.
    1. לבצע Giemsa מכתים כדי להעריך את תאי הגידול באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    2. חותכים את הסרט של השקופית ממברנה PEM על ידי לייזר מתאים ללכוד microdissection.
    3. להעביר את הסרט לחתוך צינור microcentrifuge סטרילי עם pincette והידיים בכפפות.
    4. לאחסן את הצינור microcentrifuge המכילים הסרט ב 4 ° C עד מיצוי DNA (הפרוטוקול ניתן להשהות כאן).

3. דנ א החילוץ

  1. לבצע הפקת דנ א מדגימות טיק או FFPE הרקמה באמצעות ערכת חילוץ FFPE DNA על-פי הוראות היצרן עם שינויים מזעריים. ערכת מקביל זמין עבור השלב מיצוי הדנ א FFPE.
  2. להוסיף µL 180 מאגר פירוק רקמת (ה-pH = 8.3) כדי ברכבת התחתית microcentrifuge המכיל סרט עם פיפטה 200 ידנית-µL. הוסף 20 µL של proteinase K עם פיפטה 20 ידנית-µL, שילוב על-ידי vortexing עם מערבל מערבולת במהירות מרבית (כ 2500 סל ד) עבור 5 s.
  3. דגירה בדגימות ב 56 ° C בלילה עם אינקובטור אוויר.
  4. דגירה בדגימות FFPE, טיק ב 90 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום 1 h ו- 10 דקות, בהתאמה. ספין בקצרה דרך צינור microcentrifuge ב g x 1,500 5 s בטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה מיני.
  5. להוסיף 200 µL פירוק מאגר הדגימה עם 200-µL פיפטה, לערבב ביסודיות על ידי vortexing במהירות המרבית עבור 5 s.
  6. להוסיף 200 µL של אתנול (96-100%) עם פיפטה 200-µL ולערבב היטב על ידי vortexing במהירות המרבית עבור 5 ס' בקצרה ספין דרך צינור microcentrifuge ב g x 1,500 5 s בטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה מיני.
  7. בזהירות להעביר את כל lysate העמודה ספין עם 1,000-µL פיפטה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
  8. מקם את העמודה ספין צינור נקי 2-mL אוסף עם ידיים בכפפות, ולמחוק את הצינור אוסף המכיל את הזרימה דרך לתוך קופסת פלסטיק סילוק.
  9. להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין עם 1,000-µL פיפטה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
  10. מקם את העמודה ספין צינור נקי 2-mL אוסף עם ידיים בכפפות, ולמחוק את הצינור אוסף המכיל את הזרימה דרך לתוך קופסת פלסטיק סילוק.
  11. להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין עם 1,000-µL פיפטה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
  12. למחוק את הצינור אוסף המכיל את הזרימה דרך לתוך קופסת פלסטיק סילוק. מקם את העמודה ספין צינור נקי 1.5-mL microcentrifuge עם ידיים בכפפות, צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 3 דקות 25 ° c כדי לייבש את הקרום.
  13. מקם את העמודה ספין צינור איגוד ה-DNA-נמוכה עם ידיים בכפפות.
    1. להוסיף 40-50 µL • תנאי מאגר המרכז של הקרום עם פיפטה 100-µL.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 1 דקות ב- 25 ° C.
    3. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד השלב הבא (הפרוטוקול ניתן להשהות כאן).

4. הערכה של איכות DNA על ידי בזמן אמת כמותיים PCR

  1. הכנת המיקס ראשיים צינור microcentrifuge סטרילי עם פיפטה, כדלקמן: 10 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR בזמן אמת, µL 1 של 20 x RNase P פריימר-בדיקה מיקס (גודל אמפליקון: 87 bp), ו- 8 µL של מים נטולי נוקלאז סטרילי.
  2. הכנת המיקס המאסטר השני בצינור microcentrifuge סטרילי אחת כדלקמן: 10 µL של 2 x מיקס מאסטר PCR בזמן אמת, µL 1 של 20 x RNase P פריימר-בדיקה מיקס (גודל אמפליקון: 268 bp), ו- 8 µL של מים נטולי נוקלאז סטרילי.
  3. ביצוע דילולים טורי של DNA גנומי לשליטת האדם (המסופקים בערכה) 4 פעמים עבור עיקול רגיל 5 הנקודות ולקבוע את ריכוזי מוחלט דנ א13.
  4. להוסיף µL 19 של תערובות שני מאסטר מוכן (להכין בשלב 4.1 ו- 4.2) לתוך בארות נפרדים של צלחת תגובה 96-ובכן אופטי עם פיפטה 20-µL.
  5. להוסיף 1 µL של FFPE DNA או טיק DNA כדי להפריד בארות המכיל את התמהיל התגובה עם פיפטה 2-µL. להוסיף 1 µL של מים נטולי נוקלאז לבאר נפרד המכיל את תערובת התגובה עבור הפקד בתבנית אין.
  6. להחזיק את הצד ללא דבק של סרט דביק אופטי, לקלף המגן גיבוי מהמרכז של הסרט. בעדינות לגרור את המוליך על הסרט, לאטום את הסרט יניף 96-ובכן.
  7. מערבבים בעדינות את הצלחת 96-ובכן באמצעות מערבל 96-ובכן צלחת 10 s בטמפרטורת החדר 2,000 סל ד. Centrifuge את הצלחת בקצרה-1000 g x עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. כוח על מכשיר PCR, הוסף הצלחת 96-ובכן בזמן אמת. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 45 מחזורי 95 ° C עבור 1 s ו- 60 ° C עבור 20 ס' שימוש "עיקול רגיל" ו- "מצב מהיר".
  9. להעריך את הפיצול DNA עם היחס של DNA (כימות יחסית; RQ) השיג עבור אמפליקון ארוך (268 bp) אמפליקון קצר (87 bp). RQ הוא הערך הממוצע של הערך את זמן אמפליקון אומר של קצר אמפליקון13.

5. הכנה של הספרייה רצף של הדור הבא

  1. היכונו הספרייה רצף רצף הדור הבא על פי הוראות היצרן.
  2. להכין את התמהיל מולטיפלקס PCR ראשיים צינור microcentrifuge סטרילי עבור דגימה כדלקמן: 4 µL של 5 x PCR מולטיפלקס התגובה פתרון, 4 µL של 5 x פריימר בריכה, µL ≤6 טיק או FFPE דנ א (1-100 ng), ולהוסיף מים נטולי נוקלאז 20 µL.
    1. הוסף המיקס מאסטר מולטיפלקס PCR PCR שפופרת, לערבב בעדינות על-ידי הקשה את הצינור.
    2. ספין בקצרה דרך צינור microcentrifuge ב g x 1,500 5 s בטמפרטורת החדר עם צנטריפוגה מיני.
  3. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 99 º C למשך 2 דקות, ואחריו 20 מחזורים של 99 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C 4 דקות, החזקת שלב 10 מעלות צלזיוס. בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
    הערה: לקבוע את מספר מחזורי מבוסס על מספר זוגות פריימר.
  4. פותחים את המכסה של הצינור PCR, וכן להוסיף 2 µL של האנזים הגבלה עם פיפטה 2-µL. . סגור את המכסה של צינור ה-PCR, לערבב בעדינות על-ידי הקשה הצינור PCR בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
  5. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, וצעד מחזיק 10 מעלות צלזיוס. בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
  6. להוסיף מתאם מצדו מיקס מאסטר לתוך כל טוב המכילה את amplicons ה-PCR מתעכל עם פיפטה כדלקמן: µL 4 של מתאם מצדו פתרון, 0.5 µL של ברקוד, 0.5 µL של מתאם, µL 2 של מים נטולי נוקלאז ו 2 µL של ה-DNA ליגאז. . סגור את המכסה של צינור ה-PCR, לערבב בעדינות על-ידי הקשה בקצרה ספין דרך צינור PCR עם צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר.
  7. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וצעד מחזיק 10 מעלות צלזיוס.
  8. לטהר את ספריית רצף עם חרוזים מגנטי לפי הוראות היצרן.
  9. העברת הפתרון הספרייה ובין אם-לא מתאם לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA 1.5-mL. הוסף µL 45 של beads מגנטי לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA לטיהורst 1. לערבב בעדינות על-ידי הקשה הצינור, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. למקם את הצינור איגוד ה-DNA-נמוכה מתלה מגנטי, ולאחר מכן תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר עד הפתרון ברור. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע עם פיפטה 200-µL מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  11. להוסיף 150 µL של אתנול 70% טריות עם פיפטה 200-µL ולאחר מכן להעביר את הצינור כדי לצד של המגנט לשטוף את החרוזים. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  12. חזור על שלב 5.11 לרחיצה השני.
  13. בקצרה ספין דרך צינור עם מיני צנטריפוגה ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, וזורקים בקפידה את טיפות אתנול עם פיפטה 10-µL.
  14. הוסף µL 50 של טה נמוך לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA המכיל בגדר beads מגנטי כדי לפזר את החרוזים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות עד הפתרון ברור.
  16. להעביר את µL 50 של תגובת שיקוע לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA חדש ולהוסיף µL 75 של beads מגנטי עם פיפטה 100-µL לטיהור 2nd . לערבב בעדינות על-ידי הקשה הצינור, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, ולאחר מכן תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר עד הפתרון ברור. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע עם פיפטה 200-µL מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  18. להוסיף 150 µL של אתנול 70% טריות עם פיפטה 200-µL ולאחר מכן להעביר את הצינור כדי לצד של המגנט לשטוף את החרוזים. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים מגנטי.
  19. חזור על שלב 5.18 לרחיצה השני.
  20. בקצרה לסובב דרך צינור באמצעות צנטריפוגה מיני ב 1,500 x g 5 s בטמפרטורת החדר. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, וזורקים בקפידה את טיפות אתנול עם פיפטה 10-µL.
  21. הוסף µL 50 של טה נמוך לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA המכיל בגדר beads מגנטי כדי לפזר את החרוזים. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  22. למקם את הצינור נמוך-איגוד ה-DNA מתלה מגנטי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות עד הפתרון ברור.
  23. להעביר את µL 45 של תגובת שיקוע המכיל ספריית מטוהרים לתוך הצינור נמוך-איגוד ה-DNA חדש עם פיפטה 100-µL.

6. לכמת את הריכוז ספריית מאת בזמן אמת כמותיים PCR

  1. לקבוע את הריכוז של כל ספריה על פי הוראות היצרן13.
    1. להכין פתרון דילול 20-fold כדלקמן: לערבב 2 µL של ספריית מטוהרים µL 38 של נוקלאז ללא מים בצינור נמוך-איגוד ה-DNA עם פיפטה 2-µL, 100-µL.
    2. לאחסן את ספריות מדולל ב-20 ° C עד שלב 7.3.
  2. להכין פתרון דילול 200-fold כדלקמן: לערבב µL 5 של הספרייה 20-fold מטוהרים מדולל (להכין בשלב 6.1), 45 µL של נוקלאז ללא מים בצינור נמוך-איגוד ה-DNA.
  3. להכין פתרון דילול 2,000-fold כדלקמן: לערבב µL 5 של הספרייה 200-fold מטוהרים מדולל (להכין בשלב 6.2), 45 µL של נוקלאז ללא מים בצינור נמוך-איגוד ה-DNA.
  4. מכינים את תערובת הבסיס התגובה כדלקמן: לערבב 10 µL של 2 x מיקס מאסטר פתרון 1 µL של 20 x פריימר-בדיקה פתרון assay בצינור microcentrifuge סטרילי עם פיפטה ואז לערבב על ידי הקשה על הצינור. הוסף µL 11 של המיקס מאסטר התגובה לתוך הבארות של תגובה 96-ובכן אופטי.
  5. להוסיף כל טוב עם פיפטה 10-µL µL 9 של הספרייה מדולל 2,000-fold, 9 µL של כל פקד רגיל או µL 9 של נוקלאז ללא מים.
  6. להחזיק את הצד ללא דבק של סרט דביק אופטי, לקלף המגן גיבוי מהמרכז של הסרט.
    1. בעדינות לגרור את המוליך על הסרט, לאטום את הסרט יניף 96-ובכן.
    2. מערבבים בעדינות את הצלחת 96-ובכן באמצעות מערבל 96-ובכן צלחת 10 s בטמפרטורת החדר.
    3. Centrifuge את הצלחת בקצרה-1000 g x עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. כוח על מכשיר PCR, הוסף הצלחת 96-ובכן בזמן אמת. הפעל את תגובות PCR באמצעות פרוטוקול הבאים: 50 º C למשך 2 דקות, 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 1 s ו- 60 ° C עבור 20 ס' שימוש "עיקול רגיל" ו- "מצב מהיר".
  8. לחשב את הריכוז ספריית מדולל על-ידי הכפלת ריכוז שקבע עם qPCR 2,000.

7. רצף הדור הבא

  1. התנאי בניהול ותכנון להגדיר את הפרמטר לרוץ בתוך התוכנה.
    1. לחצו על [תוכנית כרטיסיית] ו- [תבנית], ובחר את שיטת ההפעלה המתאים.
    2. בחר את יישום והסוג טכניקה, ולאחר לחץ על [הבא].
    3. בחר את כלי ערכת הכנת המדגם (אופציונלי), סוג ערכת ספריה, תבנית קיט, רצף ערכת, לבסס מצב הכיול, צ'יפ סוג, לשלוט רצף (אופציונלי), ו ברקוד סט ולאחר לחץ על [הבא].
    4. בחר תוספים ' ולחץ על ' [הבא] '.
    5. בחר פרוייקט ' ולחץ על ' [הבא] '.
    6. בחר הפניה כברירת מחדל וקבצי המיטה של אזור ממוקד.
    7. הקלד את השם לדוגמה, בחר את הברקוד, ולחץ [להפעיל תוכנית].
  2. לבצע הכנת תבנית, צ'יפ שם מכשיר אוטומטי לפי הוראות היצרן. להפשיר את מחסנית ריאגנט בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות לפני השימוש.
  3. לדלל את ספריית מדולל במים נטולי נוקלאז לפי ריכוז ספריית שחושבו בצעד 6.8 ולעשות 20 ספריות pM.
    1. היכונו ספרייה במאגר רצף וחנות על קרח.
    2. להוסיף 25 µL של הספרייה במאגר עם פיפטה 100 µL לתחתית הצינור הדגימה. השתמש במאגר הספריה בתוך 48 שעות.
  4. כוח, פתח את המכסה של הכלי האוטומטי.
    1. מקם את רצף צ'יפ צ'יפ מתאם, העשרה מחסנית, עצה מחסנית, PCR צלחת, PCR מסגרת חותם, שחזור שפופרת, פתרון מחסנית, ריאגנט מחסנית למיקום המתאים של המכשיר האוטומטי.
    2. לגעת [הגדרת הפעלה] ו- [צעד אחר צעד] על המסך.
    3. סגור את המכסה ולגעת [הסימון התחלה] על המסך.
    4. לאחר שחולקה סריקה תהליך, לגעת [הבא] על המסך.
    5. בדוק את תוכן התצוגה (סוג ערכת, סוג שבב, צ'יפ מזהה, לדוגמה מזהה, תוכניות), לקבוע את הזמן ולאחר לגעת [אישור] על המסך.
  5. לאחר שסיים את טעינת שבב:
    1. לגעת [הבא] על המסך, פתח את המכסה.
    2. פרקו את השבב רצף של שבב מתאם עם ידיים בכפפות.
    3. מקם את השבב לתוך המיכל שבב, ראפ עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 ° C עד התגובה רצף.
    4. להסיר את מחסנית העשרה PCR צלחת, PCR מסגרת חותם, שחזור שפופרת, פתרון מחסנית, ריאגנט מחסנית המיקום המתאים של המכשיר אוטומטית עם ידיים בכפפות.
    5. העברת מחסנית ריקה-טיפ למיקום עצה פסולת של המכשיר אוטומטית עם ידיים בכפפות.
    6. לגעת [הבא], סגור את המכסה.
    7. גע [התחל] ולאחר לנקות את המכשיר אוטומטית על ידי קרני אולטרה סגול במשך 4 דקות.
  6. להמיס לוח הכלוריט נתרן ב- 1,000 מיליליטר מים הנדסה גנטית ופתרון הסינון עם יחידת מסנן מסנן 0.22-מיקרומטר זרימה.
    1. כוח על הכלי רצף.
    2. לגעת [נקיים] [הבא] על המסך של המכשיר רצף.
    3. לנקות את המכשיר רצף עם 250 מ של פתרון הכלוריט נתרן מחוטא-מסנן, לאחר מכן 250 מ של מים הנדסה גנטית.
  7. לגעת [Initialize] ובחר ערכת רצף המתאים על המסך.
    1. התקנת מחסנית אפור במיקום המתאים עם ידיים בכפפות.
    2. אתחל את המכשיר רצף עם הפתרון לשטוף (המסופק בערכה), הפתרון התאמת חומציות (מכיל 350 µL של 100 מ מ נתרן הידרוקסידי) הפתרון הסטנדרטי pH (המסופק בערכה).
  8. הוסף 20 µL של dATP, dGTP, dCTP ו- dTTP נוקלאוטידים (המסופק בערכה) 50-mL צינורות (שסופק בערכה) עם פיפטה 100-µL.
    1. התקנת מחסנית אפור במיקום המתאים עם ידיים בכפפות.
    2. לטעון את שפופרת 50-mL ואת בורג על גבי המכשיר רצף.
    3. לגעת [הבא] על המסך כדי להתחיל את השלב האתחול, אשר לוקח כ 25 דקות.
  9. לאחר השלמת השלב אתחול:
    1. לגעת [הפעלה] על המסך, בחר הכלי הכנה הספריה המתאימה.
    2. סרוק את הברקוד דו-ממדית של השבב.
    3. הכנס את השבב רצף על המיקום המתאים.
    4. סגור את הדלת קלאמפ ולכלי הנגינה של צ'יפ.
    5. לגעת [שבב הסימון], [הבא], ותקינות [] על המסך כדי להתחיל בהפעלה רצף.
  10. לאחר התגובה רצף, להעביר את הנתונים ולבצע צינור-ניתוח נתונים על רצף שרת13,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את כל התהליך החל משלב הכנת טיק דגימות DNA החילוץ. ראוי לציין, התהליך לוקח רק יומיים להשיג DNA גנומי דגימות טיק. הערכנו כל תופעות של הגידול אחסון לפני עיבוד שקופיות. מצאנו כי תאים סרטניים שהיו מחוברים אל השקופית זכוכית כאשר דגימות רקמה הושפעו מיד על גבי השקופית, וכאשר רקמות הוחזקו ב- saline בטעימת-גזה סטרילית לשעה (איור 2). עם זאת, כאשר רקמות נשמרו בטמפרטורת החדר, לתאי הגידול לא טוב צורפו לשקופית. יכול לאחסן שקופיות שהוכנו מראש ב 4 מעלות צלזיוס למשך שלושה חודשים. לכן, חשוב שלא להתיר את דגימות להתייבש.

אנחנו בחנו את התועלת של השיטה שלנו ולהשוות אותם עם דגימות רכשה באמצעות FFPE. טיק דגימות FFPE הוכנו מ 14 דגימות הגידול, לנו אישר כי הגידול תוכן וטוהר יכול להיות מוערך של דגימות טיק. לאחר ביצענו צביעת Giemsa, המספר של תאים סרטניים, המורפולוגיה הגידול יכול להיות מוערך על ידי מיקרוסקופ. וכך הצלחנו באופן שגרתי להעריך את תאי הגידול ולבצע לאחר מכן ותריצו בדיקת איכות.

ה-DNA ובאיכות הוערך על ידי1514,13,ה-PCR כמותי בזמן אמת. אנחנו נקבע הכמויות DNA המוחלט ואת הערך RQ, המציין של הרמה השפלה של הדנ א. התוצאות הראו כי תשואה גבוהה יותר DNA הושג באמצעות דגימות טיק בהשוואה עם דגימות FFPE (טבלה 1). בנוסף, הערכים RQ של ה-DNA טיק משמעותית גבוה יותר הושוו עם זה של ה-DNA FFPE (איור 3, p = 2.3 x 10-8, מבחנים דו-זנבית של סטודנט t ). אנחנו גם העריכו את הערכים RQ של טיק ו- DNA FFPE מופק סוגי גידולים שונים, נמצא כי ה-DNA טיק היה גבוה יותר איכות לעומת ה-DNA FFPE (איור 3). תוצאות אלו ציינו כי ה-DNA טיק היה מפוצלת פחות מאשר ה-DNA FFPE.

אנחנו העריכו הבא אם ה-DNA טיק יכול לשמש לניתוח רצף הדור הבא. FFPE והחובות טיק הוכנו מן הראשית סרטן המעי הגס וסרטן הכבד גרורתי המתקבל מטופל (איור 4A). PCR-הגברה והכנת ספריית נערכו באמצעות לוח חמה של סרטן, רצף יישוב לאחר מכן בוצע. כתוצאה מכך, APC Q1367 * זוהה FFPE והן DNA טיק מופק באתר 1 (טבלה 2). יתר על כן, APC S1356 * קראס G12D, TP53 M237I אותרו שני FFPE, ה-DNA טיק מופק באתר 2, 3 ו- 4 (טבלה 2). תוצאות אלה הציע כי מוטציות סומאטית זהים זוהו בדגימות FFPE והחובות טיק לזווג מקריסטלים של הגידול באותו האתר (איור 4B ו לטבלה 2). ראוי לציין, מוטציות סומאטית באותו אותרו בין ראשי סרטן המעי הגס (2 באתר, לא אתר 1) שתי דגימות סרטן גרורתי בכבד, רומז שיבוטים הגידול באתר 2 גרורות לכבד (איור 4B ו לטבלה 2). יחד ממצאים אלה מראים כי ה-DNA טיק הוא באיכות גבוהה והוא מתאים עבור מגוון רחב של בדיקות גנטיות כולל רצף הדור הבא.

Figure 1
איור 1 מפרטים טכניים עבור קבלת ה-DNA של הכנת הדוגמא טיק. רקמת הגידול הוא נגע על הזכוכית שקופית כדי להכין את הדגימה טיק. לאחר הערכה של הגידול מורפולוגיה, תוכן תחת מיקרוסקופ, ה-DNA של הגידול יכול חילוצם ואופן המשמש עבור בדיקה גנטית. באמצעות טיק, הגידול DNA ניתן להשיג דגימה פתולוגית קליניים בתוך יומיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. הכנת דוגמאות טיק. דגימות הגידול Resected היו מיד נגע לשקופית זכוכית רגילה (החלונית הימנית), המשיך ב- saline בטעימת-גזה סטרילית לשעה (באמצע), והמשיך בטמפרטורת החדר במשך 1 h (מימין). מדגם #1 היה קרצינומה hepatocellular, דוגמת #2 היה סרטן השד. תמונות מיקרוסקופיות נלכדו באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב אל המיקרוסקופ. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. בדיקת האיכות DNA מוערך על ידי ניתוח כמותי PCR בזמן אמת- טיק ו- FFPE DNA היו מופק 14 גידול רקמות מן המעי הגס (n = 8), הקיבה (n = 4), סרטן כבד גרורתי (n = 2). השוואה של התוצאות כימות היחסי בין דגימות טיק-Giemsa FFPE-הוא. RQ הערכים של ה-DNA טיק היה גבוה משמעותית מזה של ה-DNA FFPE. בוצע ניתוח סטטיסטי בין שתי הקבוצות ו- p-ערכים חושבו על ידי מבחן אינטראקצית דו-זנבית של סטודנט t באמצעות Excel. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. הבא הדור רצף ניתוח נתונים באמצעות טיק ודנ א FFPE. Macroscopic (א) ותמונות מיקרוסקופיים. תמונות נציג של טיק-Giemsa ו- FFPE-הוא מכתים סרטן המעי הגס (אתר 1 ו- 2), קרצינומה גרורתית בכבד דגימות (אתר 3 ו- 4). סרגל קנה מידה בתמונות מאקרוסקופית: 1 ס מ, סולם בר בתמונות מיקרוסקופיים: 100 מיקרומטר. (B) חום מפה המציגה את ההפצה של מוטציות סומאטית עבור כל אתר גידול (n = 8). מוטציות זהים אותרו בין טיק לזווג דגימות דנ א FFPE. הערכים של שברים allelic מצוינים בקנה מידה צבע הסיום של 1% (ורוד בהיר) ל- 100% (ורוד). עמודות אפור הראה לא מזוהה מוטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טיק-Giemsa (n = 14) . הוא FFPE (n = 14)
סה כ ה-DNA (ng) סה כ ה-DNA (ng)
מדגם אתר גידול קצר ארוך RQ קצר ארוך RQ
Site1 המעי הגס 1495 1247 0.83 939 349 0.37
Site2 המעי הגס 991 1057 1.07 556 204 0.37
Site3 הכבד 467 511 1.09 130 39 0.3
Site4 הכבד 2172 2115 0.97 488 127 0.26
Site5 המעי הגס 749 598 0.8 529 205 0.39
Site6 הקיבה 330 286 0.86 ולגובה 211 98 0.46
Site7 הקיבה 636 499 0.78 154 84 0.55
Site8 הקיבה 27 27 1.01 135 81 0.6
Site9 המעי הגס 1986 1611 0.81 476 163 0.34
Site10 המעי הגס 280 218 0.78 209 83 0.39
Site11 המעי הגס 1546 575 0.37 366 159 0.43
Site12 הקיבה 1501 1200 0.8 274 132 0.48
Site13 המעי הגס 1556 1404 0.9 326 179 0.55
Site14 המעי הגס 1565 1210 0.77 680 295 0.43
Mean±SD 1093±682 897±600 0.85±0.18 391±253 157±86 0.42±0.10

טבלה 1. דנ א איכות הנתונים. לזווג טיק (n = 14) ו FFPE דגימות (n = 14) הוכנו המעי הגס, הכבד, סרטן הקיבה. טיק הדגימות היו מוכתמים Giemsa, דוגמאות FFPE היו מוכתמים hematoxylin ואאוזין (הוא). דגימות די אן איי היו חילוץ, לכמת על ידי ה-PCR כמותי בזמן אמת עם שני זוגות פריימר הגברה לוקוס RNaseP (אמפליקון ארוך (268 bp) ו אמפליקון קצר (87 bp)). RQ ערכים חושבו כדלקמן: הערך הממוצע של אמפליקון ארוך מחולק לפי הערך הממוצע של אמפליקון קצר. SD, סטיית תקן; RQ, כימות היחסי

לדוגמה שם מיקום הכנה סמל הגן מוטציה מיקום הפניה משתנה קידוד כיסוי שבר allelic
סרטן המעי הגס ראשוני אתר 1 FFPE APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1999 45%
סרטן המעי הגס ראשוני אתר 1 טיק APC Q1367 * chr5:112175390 C T c.4099C > T 1011 72%
סרטן המעי הגס ראשוני האתר 2 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1968 77%
סרטן המעי הגס ראשוני האתר 2 FFPE קראס G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 52%
סרטן המעי הגס ראשוני האתר 2 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1991 73%
סרטן המעי הגס ראשוני האתר 2 טיק APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1967 89%
סרטן המעי הגס ראשוני האתר 2 טיק קראס G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1994 56%
סרטן המעי הגס ראשוני האתר 2 טיק TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 86%
גרורות סרטן הכבד באתר 3 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1974 92%
גרורות סרטן הכבד באתר 3 FFPE קראס G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1995 62%
גרורות סרטן הכבד באתר 3 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1296 91%
גרורות סרטן הכבד באתר 3 טיק APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1964 97%
גרורות סרטן הכבד באתר 3 טיק קראס G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1993 64%
גרורות סרטן הכבד באתר 3 טיק TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1998 95%
גרורות סרטן הכבד אתר 4 FFPE APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1965 93%
גרורות סרטן הכבד אתר 4 FFPE קראס G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 60%
גרורות סרטן הכבד אתר 4 FFPE TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1993 92%
גרורות סרטן הכבד אתר 4 טיק APC S1356 * chr5:112175358 C A c.4067C > A 1960 94%
גרורות סרטן הכבד אתר 4 טיק קראס G12D chr12:25398284 C T c.35G > A 1992 62%
גרורות סרטן הכבד אתר 4 טיק TP53 M237I chr17:7577570 C A c.711G > T 1995 95%

בטבלה 2. השוואה של מוטציות לזווג FFPE והחובות טיק זוהה על ידי ניתוח רצף יישוב. מדגמים מזווגים טיק ו FFPE הוכנו 2 ראשי סרטן המעי הגס (אתר 1 ו- 2) ו- 2 גרורות בכבד סרטן (אתר 3 ו- 4). רצף יישוב בוצעה עם דגימות די אן איי האלה, זוהו מוטציות סומאטית. מוטציה פרופילים היו זהים בין טיק לזווג דגימות דנ א FFPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, הצגנו שיטה חלופית להשגת גידול הדנ א של דגימות פתולוגיים קליניים באמצעות טיק. טיק ההכנה היא פשוטה מאוד וזקוק בפחות זמן לעומת שיטות FFPE, ללא הדרישה מכשירים מיוחדים10. כל ההליכים משלב הכנת טיק כדי מיצוי הדנ א יכולה להסתיים בתוך יומיים (איור 1). שיטה זו ובכך מקצר את משך העבודה על ביצוע בדיקה גנטית. ראוי לציין, זה מספק יתרון משמעותי קיצור מספר הימים הנדרשים לבדיקה מולקולרית. זמן אספקה קצר זה מאפשר לנו להציע טיפול המתאים באופן מיידי לחולי סרטן מתקדם הזקוקים סמים מולקולרי יישוב. שיטה זו מספקת ולכן היתרונות ניתוחים של שינויים גנטיים בגידולים ומינהל של יישוב מולקולרי תרופות לטיפול בסרטן.

ישנם כמה נקודות מפתח להצלחה של שימוש טיק DNA עבור ניתוח גנטי. גידול רקמות ייתכן נמק עקב טיפול כגון כימותרפיה או טיפולים אחרים. לפיכך, זהירות יש צורך בהכנת טיק דגימות להימנע דגימה ממקטעים נמק בגידול ככל האפשר. עוד יותר, הערכה ראשונית מיקרוסקופי הוא מאוד חשוב עבור ההליכים הבאים. בנוסף, מניעת הייבוש של גידול רקמות נדרש עבור הכנת הדוגמא טיק מוצלחת. אם רקמות הגידול עוברות ייבוש, התוצאה פחות תאים המצורפת בשקופית זכוכית. זה יהיה גם קשה להתבונן על גידול cellularity ועל מורפולוגיה בגלל ייבוש מוביל לניוון של גידול רקמות.

ישנם כמה יתרונות פוטנציאליים באמצעות DNA טיק. קודם כל, אנחנו יכולים לבדוק את cellularity הגידול במהלך המבדק הראשונה עם מיקרוסקופ. אם תאים נורמליים, כמו לימפוציטים ותאים סטרומה, בשפע דגימות רקמה, הזיהום של אלו תאים נורמליים תמנע את היכולת לזהות מוטציות סומאטית בתאי הגידול. הערכה מהירה מיקרוסקופיים של הדגימות עשוי לסייע הערכת cellularity הגידול והשערוך של דגימות די אן איי גידול נאותים, התקבלו הדגימות טיק לפני מיצוי הדנ א. שנית, התוצאות שלנו הראו כי ה-DNA טיק הוא שניהם גבוהה מבחינה איכותית. FFPE DNA שימש לצורך ניתוח רצף הדור הבא, כולל רצף יישוב, exome רצף הגנום כל רצף16,17,18,19,20. ארכיון FFPE DNA משמש גם באופן שגרתי ניתוח גנטי21,22, אולם FFPE DNA עשוי להיות מפוצל במהלך קיבוע פורמלין. זה יכול לגרום לבעיות ב- PCR הגברה או מיצוי הדנ א, גורם חוסר רצף כיסוי, אחידות בכל אזורי היעד, להגביר את הסיכון של רצף שגיאה23,24. לעומת זאת, טיק דנ א לא יהיה מפוצל, אשר יכול להיות בגלל הקיבעון אלכוהול יש פחות השפעה על חומצות גרעין. כמו טיק דנ א לא יהיה מפוצל כמו ה-DNA FFPE, דגימות אלה יהיה יותר מתאים ניתוח רצף ' הדור הבא ', בזמן אמת PCR ו- PCR דיגיטלי. ואכן, בעבר הראינו כי טיק הדנ א הדגימה הגידול ניתן להשתמש בניתוח הדור הבא רצפי, שיטה הנקראת "טיק-seq", וכי התוצאות בדיוק יכול לתפוס את הגידול מוטציות סומאטית13. שלישית, טכניקה זו ישימה עבור מגוון רחב של חומרים. בדו ח הנוכחי, השתמשנו דגימות כירורגי. בנוסף כירורגית לרקמות, גרורות הלימפה, ביופסיה הסמפונות או אנדוסקופי יכול לשמש להכנת טיק DNA.

לסיכום, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה להכנת DNA הגידול באיכות גבוהה באמצעות דגימות טיק. שיטה זו להרחיב את אפשרויות חדשות בתחום ניתוח גנטי ולעזור לקדם את הרפואה דיוק בהגדרה קלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים כל הצוות הרפואי ואת נלווים של החולים ושל המטופלים על מסכים להשתתף. אנו מודים גבריאל לבן וולף, PhD, מקבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) עבור עריכת טיוטה של דו ח זה. מחקר זה נתמך על ידי מענק הסיוע פרויקט מחקר הגנום של פריפקטורה של יאמאנאשי (י. ח, שיטת הפעולה), מענק מ של יאסאדה רפואי קרן (י. ח).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FINE FROST white20 micro slide glass Matsunami Glass ind, Ltd SFF-011
Arcturus PEN Membrane Glass Slides Thermo Fisher Scientific LCM0522
Cyto Quick A solution Muto Pure Chemicals 20571
Cyto Quick B solution Muto Pure Chemicals 20581
May-Grunwald Solution Muto Pure Chemicals 15053
Giemsa solution Muto Pure Chemicals 15002
QIAamp DNA FFPE tissue kit Qiagen 56404
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit Thermo Fisher Scientific 4316831
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 Thermo Fisher Scientific 4324034
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate  Thermo Fisher Scientific 4346907
MicroAmp optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971
MicroMixer E36 TITEC 0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific VIIA7-03
Himac CF16RXII Hitachi-koki CF16RII
Ion Library TaqMan Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 Thermo Fisher Scientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Thermo Fisher Scientific 4480442
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit Thermo Fisher Scientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) Thermo Fisher Scientific A30044
Ion Chef System Thermo Fisher Scientific 4484177
Veriti 96-well Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific Veriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BC Thermo Fisher Scientific 4488150
Ion PGM System Thermo Fisher Scientific PGM11-001
Ion PGM Wash 2 Bottle kit Thermo Fisher Scientific A25591
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
16-position Magnetic Stand Thermo Fisher Scientific 4457858
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) Thermo Fisher Scientific AM12450
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9938
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates Thermo Fisher Scientific 4306737
MicroAmp™ Clear Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4306311
Agencourt™ AMPure™ XP Kit Beckman Coulter A63881
Ethanol(99.5) Nacalai Tesque 08948-25
Sodium hydroxide (10M) Sigma 72068
DTU-Neo TAITEC 0063286-000
E-36 TAITEC 0027765-000
ECLIPSE Ci-L Nikon 704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ METTLER TOLEDO 17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ METTLER TOLEDO 17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ METTLER TOLEDO 17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ METTLER TOLEDO 17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ METTLER TOLEDO 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ METTLER TOLEDO 17014382
petit-change WAKEN MODEL8864 Mini centrifuge
petit-incubator WAKEN WKN-2290 Air incubator
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves MEDLINE SEM486802
Sterile gauze Osaki 11138
Refrigerator MediCool SANYO MPR-312DCN-PJ
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.130
FEATHER TRIMMING BLAD FEATHER No.260
FEATHER S FEATHER FA-10
Vortex Genius 3 IKA 41-0458 Vortex mixer
Pincette NATSUME A-5
1.5 mL microtube BIOBIK RC-0150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
  2. Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  3. Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
  4. Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
  5. Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
  6. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
  7. Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
  8. Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
  9. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  10. Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
  11. Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
  12. Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
  13. Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
  14. Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
  15. Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
  16. Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
  17. Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
  18. Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
  19. Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
  20. Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
  21. Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
  22. Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
  23. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
  24. Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).

Tags

לחקר הסרטן גיליון 133 DNA גידול לגעת ההטבעה ציטולוגיה FFPE פיצול סרטן
שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., … More

Amemiya, K., Hirotsu, Y., Oyama, T., Omata, M. Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology. J. Vis. Exp. (133), e56943, doi:10.3791/56943 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter