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Genetics

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58089
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 3, 1,2, 3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Abstract

Bis heute sind mehrere Stammzelltypen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien im Fokus für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen. Jedoch beeinträchtigt bestimmte Aspekte wie anfängliche massive Zelltod und geringen therapeutischen Wirkungen, ihre breite klinische Übersetzung. Gentechnische Veränderung von Stammzellen vor der Transplantation erwies sich als eine vielversprechende Methode zur therapeutischen Stammzellen Effekte optimieren. Sichere und effiziente gen-Delivery-Systeme fehlen jedoch noch. Daher kann die Entwicklung geeigneter Methoden einen Ansatz zur Lösung der aktuellen Herausforderungen stammzellbasierte Therapien bieten.

Dieses Protokoll beschreibt die Gewinnung und Charakterisierung von menschlichen dental follikelstimulierendes Stammzellen (hDFSCs) sowie ihre nicht-viralen genetischen Veränderung. Die postnatale zahnmedizinische Follikel enthüllt als vielversprechende und leicht zugängliche Quelle für die Ernte von multipotenten Stammzellen besitzen hohe Verbreitung Potenzial. Die beschriebenen Isolierung-Verfahren stellt eine einfache und zuverlässige Methode zur hDFSCs von Weisheitszähne Ernte. Dieses Protokoll umfasst auch Methoden zur Stammzell-Merkmale der isolierten Zellen definieren. Für gentechnische Veränderung von hDFSCs ist eine optimierte kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie ermöglicht hocheffiziente MicroRNA-Einführung vorgelegt, ohne zytotoxische Wirkungen verursacht. Micro-RNAs sind geeignete Kandidaten für vorübergehende Zelle Manipulation, wie diese kleinen translationale Regler das Schicksal und das Verhalten von Stammzellen ohne die Gefahr der stabilen Genom Integration zu kontrollieren. Dieses Protokoll stellt ein sicheres und effizientes Verfahren zur Konstruktion von hDFSCs, die wichtig für die Optimierung ihrer therapeutischen Wirksamkeit werden können.

Introduction

Die menschlichen zahnmedizinische Follikel ist eine lose Ectomesenchymally abgeleitet Bindegewebe rund um den dritten Zahn1,2. Neben seiner Funktion, Osteoclastogenesis und Osteogenesis für den Zahn-Ausbruch-Prozess zu koordinieren birgt dieses Gewebe Stamm- und Vorläuferzellen Zellen vor allem für die Entwicklung des Parodonts3,4,5. Daher gilt die zahnmedizinische Follikel als alternative Energiequelle menschliche adulte Stammzellen6,7zu ernten.

Mehrere Studien bewiesen, dass menschliche dental follikelstimulierendes Stammzellen (hDFSCs) in der Lage, Differenzierung in der parodontalen Linie einschließlich der Osteoblasten, Fibroblasten Bänder- und Cementoblasts8,9,10 . Darüber hinaus diese Zellen erwiesen sich alle Merkmale des mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) einschließlich selbst erneuernde Kapazität, Einhaltung von Kunststoff, Ausdruck der spezifischen Oberflächenmarker übereinstimmen (z. B., CD73, CD90, CD105) sowie als osteogene adipogenen und Chondrogenic Differenzierung möglicher11,12,13. Andere Studien zeigten auch eine neuronale Differenzierung Potenzial von hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Aufgrund ihrer vielversprechenden Eigenschaften und einfachen Zugang wurde hDFSCs vor kurzem relevant für Tissue engineering19,20,21. Die ersten Studien konzentrierten sich auf das Potenzial der DFSCs, Knochen, parodontale Regeneration und Zahn Wurzeln19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Seit das Wissen der neurogenen Fähigkeit des hDFSCs ist ihre Anwendung als potenzielle Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen untersuchten31,32,33. HDFSCs haben auch Bedeutung in Bezug auf die Regeneration des anderen Geweben (z.B. Hornhaut-Epithel)34,35. Das therapeutische Potenzial von hDFSC basiert nicht nur auf ihre direkte Differenzierung Potenzial, sondern auch auf ihre parakrine Aktivität. Vor kurzem haben hDFSCs gezeigt, dass eine Fülle von bioaktive Faktoren, wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Hepatozyten Wachstum absondern Faktor (HGF), die eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese, Immunmodulation, extra zellulären Matrix Modellierung und reparative Prozesse36spielen.

Breite klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie ist jedoch immer noch durch verschiedene Herausforderungen, wie massive erste Zelltod und niedrigen positiven Stammzellen Effekte37,38beeinträchtigt. Gentechnik stellt eine vielversprechende Strategie zur Bewältigung dieser Herausforderungen und können daher erheblich verbessern die therapeutische Wirksamkeit von Stammzellen38,39,40. Für vorübergehende Zelle Manipulation sind Micro-RNAs (MiRs) geeignete Kandidaten, wie diese kleinen translationale Regler, das Schicksal und das Verhalten von Stammzellen ohne die Gefahr von stabilen Genom Integration41,42, Steuern 43. bisher mehrere vorteilhafte MiRs identifiziert wurden Stamm Zellproliferation, überleben, Homing, parakrine Aktivität sowie deren Differenzierung in verschiedene Linien44zu fördern. MiR-133a entwickelt beispielsweise MSCs zeigte ein verlängertes Überleben und Engraftment aufrecht, wodurch eine verbesserte Herzfunktion im Vergleich zu unveränderten MSCs45Rattenherzen. Ebenso zeigten MiR-146a überexprimierenden MSCs höhere Mengen an VEGF absondern, was wiederum zu einer verbesserten therapeutischen Effizienz im ischämischen Gewebe46geführt.

Diese Handschrift enthält ein detailliertes Protokoll für die selektive Extraktion und gentechnische Veränderung von hDFSCs. Zu diesem Zweck haben wir die Ernte- und enzymatische Verdauung von menschlichen zahnmedizinische Follikel sowie die nachträgliche Isolierung der hDFSCs beschrieben. Um isolierte Zellen zu charakterisieren, wurden wichtige Hinweise für die Überprüfung der MSC Eigenschaften gemäß den Richtlinien der International Society for Zellulartherapie13aufgenommen. Darüber hinaus bieten wir eine ausführliche Beschreibung zur Erzeugung von MiR modifiziert hDFSCs durch die Anwendung einer kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie und die Bewertung der Effizienz der Transfektion und Zytotoxizität.

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Protocol

HDFSCs sind isoliert die zahnmedizinische Follikel der extrahierte Weisheitszähne, die von der Abteilung für Mund- und plastische Gesichtschirurgie des Universitätsklinikum Rostock zur Verfügung gestellt. Einwilligung nach Aufklärung und schriftliche Genehmigung wurde von allen Patienten erhalten. Diese Studie wurde von der lokalen Ethikkommission der Universität Rostock (Erlaubnis No. A 2017-0158) ermächtigt.

1. Isolierung der hDFSCs

Hinweis: Um bakterielle Kontamination zu verhindern, sollten Weisheitszähne nicht vor der Extraktion ausgebrochen

  1. Vorbereitung der erforderlichen Lösungen
    1. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten / Penicillin-Streptomycin-Glutamin (P-S-G) Lösung: 495 mL PBS mit 5 mL P-S-G-Lösung vermischen. Lagern Sie Aliquote von 50 mL bei 4 ° c
    2. HDFSC Kulturmedium vorbereiten: 445 mL basal Medium mit 5 mL des Antibiotika-Agents und 50 mL der fetalen bovine Serum (FBS) mischen. Shop bei 4 ° C.
    3. Bereiten Sie Kollagenase Typ ich Lager Lösung (30 mg/mL): 300 mg Kollagenase Typ ich in 10 mL basal Medium mit 1 % antibiotische Mittel ergänzt zu verdünnen. Mischen Sie kräftig die Lösung. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2 µm-Filter. Store Aliquote von 500 µL der Kollagenase Typ I Vorratslösung bei-20 ° C.
    4. Dispase II-Stammlösung (40 mg/mL) vorbereiten: Dispase II 40 mg in 10 mL basal Medium ergänzt mit 1 % antibiotische Mittel zu verdünnen. Mischen Sie kräftig die Lösung. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2 µm-Filter. Shop-Aliquote von 500 µL der Stammlösung Dispase II bei-20 ° C.
  2. Chirurgischer Eingriff
    1. Eine ausreichende Menge zu injizieren (maximal: 2 mL) von Lokalanästhetika.
    2. Schaffen und eine dreiseitige Schleimhautlappen Klappe erhöhen. Eine mehrsprachige Klappe anheben ist nicht erforderlich.
    3. Schützen Sie den sprachlichen Aspekt mit einer periostalen Aufzug.
    4. Sanft Mühle bukkal und distalen Knochen mit einer Runde harte Metall Burr.
    5. Lösen Sie das Gewebe der Follikel mit einer periostalen Aufzug. Entfernen Sie vorsichtig den kompletten Zahn (Keim) und Follikel durch Herausziehen der Krone (und Follikel) mit einer Pinzette posterior (dritte Molar).
    6. Debride und die Buchse mit NaCl-Lösung gründlich zu bewässern.
    7. Ersetzen Sie die Schleimhautlappen Klappe mit Vicryl Nähte (siehe Tabelle der Materialien).
    8. Entfernen Sie den Zahn Follikel aus der Mundhöhle und legen Sie sie in einem aliquoten 50 mL PBS/P-S-G-Lösung.
      Hinweis: Die Probe kann bei 4 ° C gelagert werden, bis die Weiterverarbeitung.
  3. Enzymatische Verdauung des Follikels, der Zahn
    1. Wärmen Sie hDFSC Kulturmedium und PBS/P-S-G-Lösung auf Raumtemperatur (RT vor).
    2. Tauen Sie ein Aliquot der jeweiligen Kollagenase, I und Dispase II auf Lagerlösungen. Bereiten Sie eine Verdauung-Lösung von 3 mg/mL Kollagenase Typ I und 4 mg/mL Dispase II durch Zugabe von 500 µL jeder Kollagenase Typ I und Dispase II-Stammlösung bis 4 mL des basalen mittlere enthält 1 % Antibiotika Agent.
    3. Extrahierten Follikel in eine sterile Petrischale geben Sie und 10 mL PBS/P-S-G-Lösung des entnommenen Gewebes zu waschen. Wiederholen Sie waschen zweimal.
    4. Hacken Sie die extrahierte Follikel in Stücke von etwa 1 mm x 1 mm mit einem sterilen Skalpell in der Petrischale mit 10 mL PBS/P-S-G-Lösung.
    5. Übertragen Sie Hackfleisch / Gewebe und PBS/P-S-G-Lösung in einem konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL aus der Petrischale. Waschen Sie die Petrischale mit 10 mL PBS/P-S-G-Lösung und übertragen Sie die Lösung in das gleiche Rohr.
    6. Zentrifugieren Sie der konischen Zentrifugenröhrchen für 10 min bei 353 X g bei RT und verwerfen Sie den überstand.
    7. Das gebeizte Gewebe 5 mL Aufschlusslösung hinzufügen. Mischen Sie die Lösung und das Gewebe vorsichtig. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C und 5 % CO2 für 2 h in einem schütteln Inkubator.
    8. Zentrifuge Zellgewebe/Federung bei 353 X g für 10 min bei RT. verwerfen des Überstands verdaut und neu gewonnene Pellet in 6 mL Kulturmedium hDFSC auszusetzen.
    9. Samen Zellsuspension in einem 25 cm2 Zell-Kultur-Kolben und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 20 % O2.
      Hinweis: Wenn Gewebe nicht vollständig verdaut, übertragen Sie das restliche Gewebe auf der Zelle-Kultur-Kolben sowie.
    10. Ändern Sie Medium sorgfältig 24 h nach Aussaat der Zelle. Danach wechselt Medium alle drei Tage bis Konfluenz.
      Hinweis: HDFSCs sollte Kunststoff-Anhänger 24 h nach Aussaat Zelle und aus nicht-anhaftende Zellen und Blutbestandteilen getrennt werden können, indem Sie einfach das Medium.
  4. Zelle zu ernten
    1. Wärmen Sie hDFSC Kulturmedium, PBS/P-S-G-Lösung und Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Lösung für RT vor
    2. Verwerfen Sie den Überstand von Kultur Kolben zu und waschen Sie konfluierende Zellen mit 5 mL PBS/P-S-G-Lösung.
    3. Die Kultur-Flasche 1 mL Trypsin/EDTA-Lösung hinzufügen und 3 Minuten bei 37 ° c inkubieren Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 3 mL hDFSC Kulturmedium in den Kultur-Kolben.
    4. Übertragen Sie Zellsuspension in einem konischen Zentrifugenröhrchen 15 mL und Zentrifugieren Sie die Aufhängung für 10 min bei RT verwerfen des Überstands 353 X g und wieder auszusetzen Sie das Pellet in angemessener Höhe hDFSC Kulturmedium.
    5. Zählen von Zellen: 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau Lösung vorsichtig mischen. 10 µL in einer Zählkammer anwenden und die hDFSC Zelle berechnen.

2. Charakterisierung von hDFSCs

  1. Die Immunphänotypisierung
    1. Vorbereitung der durchflusszytometrischen Analyse von Zellen
      1. Vorbereitung der erforderlichen Lösungen
        1. PBS/EDTA (2 mM) Vorbereitung: Mischen Sie 996 mL PBS mit 4 mL EDTA (0,5 M).
        2. Bereiten Sie Färbung Puffer: 995 mL PBS/EDTA (2 mM) mit 5 g der BSA zu mischen. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 µm-Filter-Einheit und bis zur Verwendung bei 4 ° C lagern.
        3. Vorbereiten von Paraformaldehyd (PFA)-Stammlösung (4 %): 4 g PFA in 100 mL PBS verdünnen und die Lösung auf 80 ° c erhitzen Mischen Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert auf 7,3. Aliquoten erhalten PFA Lösung im jeweiligen Beträge (1,5 mL) und im Store bei-20 ° C bis zum Einsatz.
          Achtung: Da PFA Dämpfe giftig sind, bereiten Sie die PFA-Lösung in einem gelüfteten Abzug.
      2. Übertragen Sie nach der Ernte (1.4) Zelle 14 Proben von 5 x 104 Zellen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
        Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum. Zellen und Reagenzien auf Eis zu halten, sofern nicht anders angegeben.
      3. Wieder aussetzen Sie Zellen in bestimmten Mengen an Färbung Puffer (4 ° C) und fügen Sie FcR Reagenz (4 ° C) blockiert, wie in Tabelle 1angegeben.
      4. Die folgenden Antikörper auf der Innenseite der jeweiligen Probe hinzufügen, wie in Tabelle 1angegeben: Allophycocyanin (APC) Maus Anti-Human CD29; APC-Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)-Cyanine5.5 Maus Anti-Human CD44; PerCP-Cyanine5.5 Maus IgG2b κ Isotype Kontrolle; V500 Maus Anti-Human CD45; V500 Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; Phycoerythrin (PE) Maus Anti-Human CD73; PE-Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; PerCP-Cyanine5.5 Maus Anti-Human CD90; PerCP-Cyanine5.5 Maus IgG1 κ Isotype Kontrolle; Anti-Human CD105 Maus: Alexa Fluor (AF) 488; Maussteuerung IgG1 negativ: AF488; PE-Cyanine7 Maus Anti-Human CD117; PE-Cyanine7 Maus IgG1, κ Isotype Kontrolle. Nach jeder Probe Antikörper hinzugefügt wurden, spin-down Antikörper und vorsichtig mischen. Inkubieren Sie die Lösungen für 10 min bei 4 ° c
      5. Fügen Sie 1 mL PBS (4 ° C) und Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
      6. Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 µL PBS (4 ° C) und fügen Sie 33 µL PFA (4 %). Mischen Sie die Lösungen und bis zur durchflusszytometrischen Analyse auf Eis oder bei 4 ° C lagern.
    2. Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von Zellen
      Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Messung.
      1. Um den Ausdruck von Oberflächenantigenen untersuchen, übertragen Sie Proben in Röhren geeignet für Durchflussmessungen durchflusszytometrischen.
      2. Messen Sie mindestens 2 x 104 Veranstaltungen mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie, wie in Abbildung 2dargestellt.
  2. Multipotenten Differenzierung Potenzial der hDFSCs
    1. Verwenden Sie eine handelsübliche menschlichen mesenchymalen Stem Cell funktionale Identifikation Kit adipogenen osteogene und Chondrogenic Differenzierung Potenzial von hDFSCs bestätigen. Gelten Esel Anti-Ziege AF488 Sekundärantikörper zum Beizen von Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4) und Aggrecan sowie Esel Anti-Maus AF488 Sekundärantikörper zum Beizen von Osteocalcin. Verwenden Sie für die Färbung der Kerne Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
      Hinweis: Bereiten Sie Proben ohne primären Antikörper als Negativkontrollen für mikroskopische Analysen.
    2. Analysieren Sie Expression von Proteinen durch Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie. Mikroskopie-Einstellungen: 40 X Objektiv mit Ölimmersion; Erregung Laser 488 nm (für AF488) und 405 nm (für DAPI).

3. die Transfektion von hDFSCs

  1. Samen Sie nach der Ernte (1.4) Zelle hDFSCs auf einer 24-Well Zellplatte Kultur 24 h vor Transfektion.
    Hinweis: Zelldichte ist ca. 4 x 104 Zellen pro Bohrloch. Zellen sollten am Tag der Transfektion Zusammenfluss ~ 80 % erreichen.
    Hinweis: Saatgut eine zusätzliche Zelle Probe als Steuerung für durchflusszytometrischen Analyse.
  2. Vorbereitung der Transfektion komplexe
    Hinweis: Zur Vermeidung von Kontamination durch RNases Reinigen des Arbeitsbereichs direkt vor der Zubereitung der Transfektion komplexe mit RNase Dekontaminationslösung. Verwenden Sie nur RNase-freie Material und Lösungen.
    Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum.
    1. Bereiten Sie MiR Stammlösung (50 µM): erneut aussetzen Cy3 gekennzeichnet Vorläufer MiR (5 Nmol) in 100 µL Nuklease-freies Wasser. Aliquoten erhalten MiR Stammlösung in entsprechenden Mengen (5 µL) und Store im Dunkeln bei-20 ° C bis zum Einsatz.
    2. Verdünnen Sie 40 Pmol von MiR (0,8 µL der MiR-Vorratslösung 50 µM) in 66,7 µL reduzierte Serum-Medium. Die Lösung vorsichtig mischen
    3. Verdünnen Sie 0,67 µL kationischen Lipid-basierte Transfection Reagens in 66,7 µL reduzierte Serum-Medium. Die Lösung vorsichtig mischen und 5 min bei RT inkubieren
    4. Nach der Inkubation vorverdünnt Transfection Reagens hinzufügen der vorverdünnt MiR. Die Lösung vorsichtig mischen und 15 min bei RT inkubieren
  3. Fügen Sie die vorbereiteten Transfektion komplexe tropfenweise direkt an das Kulturmedium auf Zellen. Mischen von 24 wohlen Kultur Zellplatte hin und her schaukeln.
  4. Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 20 % O2 für 24 h.

4. Analyse der Transfektion

Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum.

  1. Zelle nach Transfektion Ernte
    Hinweis: Sammeln Sie alle Zelle Lösungen einer Probe in der gleichen konische Zentrifugenröhrchen 15 mL.
    1. 24 h nach Transfektion, sammeln den Überstand der Proben im jeweiligen Zentrifuge Röhren.
    2. Zellen mit 1 mL PBS waschen, übertragen PBS in den jeweiligen Zentrifugenröhrchen geben und 500 µL Trypsin/EDTA (RT) Zellen. Inkubieren Sie die Lösungen für 3 min bei 37 ° c
    3. Trypsinization durch Zugabe von 1 mL Kulturmedium (RT) auf die Zellen und Transfer der Lösung in den jeweiligen Zentrifugenröhrchen zu stoppen. Zentrifuge Zellen bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
      Hinweis: Halten Sie aus dieser Zeit Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
  2. Vorbereitung der durchflusszytometrischen Analyse von Zellen
    1. Verwerfen Sie den überstand. Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 µL Färbung Puffer (4 ° C) und Transferlösung Zelle zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    2. Den Proben 0,5 µL Amin Reaktivfarbstoffen zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen hinzugefügt. Vorsichtig mischen Sie die Lösung und 10 min bei 4 ° c inkubieren
    3. Fügen Sie 1 mL PBS (4 ° C) Zellen und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
    4. Wieder aussetzen Sie Zellen in 100 µL PBS (4 ° C) und fügen Sie 33 µL PFA (4 %). Mischen Sie die Lösungen und bis zur durchflusszytometrischen Analyse auf Eis oder bei 4 ° C lagern.
  3. Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von Zellen
    Hinweis: Führen Sie die folgende Arbeiten in einem eher schattigen Raum. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Messung.
    1. Übertragen Sie Proben in Röhren geeignet für Durchflussmessungen durchflusszytometrischen.
    2. Untersuchen Sie Zellviabilität und MiR Aufnahme Effizienz mit einem Durchflusszytometer. Messen Sie mindestens 2 x 104 Veranstaltungen. Verwenden Sie die gating Strategie in Abbildung 4dargestellt.
      Hinweis: Verwenden Sie untransfected Zellen als Negativkontrolle, arrangieren die Anspritzung Cy3 positive Zellen und Zelltod verursacht durch Transfektion zu berechnen.

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Representative Results

Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Isolierung Anleitung hDFSCs aus menschlichen zahnmedizinische Follikel Gewebe zu ernten. Aufgrund der Anbindung des zahnmedizinischen Follikels während der routinemäßigen Operation ist es eine vielversprechende Quelle für die Gewinnung von adulten Stammzellen.

Die isolierten hDFSCs zeigte alle Merkmale für die Definition von MSCs13beschrieben. In der Tat waren Zellen Kunststoff-Anhänger unter Kulturbedingungen beschrieben und eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie (Abbildung 1) angezeigt. Flow durchflusszytometrischen Analysen ergaben, dass hDFSCs ein Gremium von bestimmten Oberflächenantigenen ausgedrückt, einschließlich CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105, während CD45 und CD117 abwesend (Abbildung 2). Darüber hinaus die adipogenen osteogene und Chondrogenic Differenzierung Potential der Zellen unter bestimmten in-vitro-Kultur, Bedingungen bestätigte Immunostaining der Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4), Osteocalcin und Aggrecan (Abbildung 3).

Die beschriebenen kationischen Lipid-basierte Transfektion Strategie konnte effiziente transiente gentechnische Veränderung von hDFSCs mit einer MiR-Akzeptanz bei ~ 100 % der lebensfähigen Zellen 24 h nach Transfektion (Abbildung 4 b). Darüber hinaus transfizierten (Abb. 4A) und untransfected (Abbildung 4) Proben zeigten vergleichbare Mengen von abgestorbenen Zellen, die sanfte Zelle Verarbeitungsbedingungen beweisen.

Figure 1
Abbildung 1: repräsentative Licht Mikroskop-Bild von hDFSCs. Zellen zeigen eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie unter standard Kulturbedingungen.

Figure 2
Abbildung 2: repräsentative Fluss durchflusszytometrischen Immunphänotypisierung der hDFSCs. Durchflusszytometrischen Analyse der Zellen nach der Färbung für bestimmte Zelle Oberflächenmarker (blau). Entsprechenden Isotype Kontrollen dienten als Negativkontrollen (grau). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: repräsentative Überprüfung der adipogenen, osteogene und Chondrogenic Differenzierung Potenzial von hDFSCs. Nach Differenzierung wurden Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten mit Immunostaining von (A) Fettsäure-bindendes Protein 4 (FABP4) (grün), (B) Osteocalcin (grün) und (C) Aggrecan (grün) gekennzeichnet. Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: repräsentative Anspritzung Strategie zur Analyse der Transfektion. Schematische Darstellung der Strategie verwendet für die Quantifizierung von (A) Zytotoxizität gating (blau: abgestorbene Zellen) und (B) Cy3 beschriftet MiR Aufnahme Effizienz (rot: Cy3+ Zellen) 24 h nach Transfektion. Untransfected Zellen (C,D) dienten als Kontrolle.

MACS FcR Antikörpern [µL] Isotype Kontrollen [µL]
Probe Puffer blockieren CD29 CD44 CD45 CD73 CD90 CD105 CD117 APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7
[µl] Reagenz [µl] APC PerCP-Cy5.5 V500 PE PerCP-Cy5.5 AF488 PE-Cy7 IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
1 30 10 10
2 37,5 10 2.5
3 37,5 10 2.5
4 30 10 10
5 35 10 5
6 35 10 5
7 37,5 10 2.5
8 30 10 10
9 30 10 10
10 37,5 10 2.5
11 30 10 10
12 40 10 10
13 30 10 5
14 37,5 10 2.5

Tabelle 1: Pipettieren Layout für die Immunphänotypisierung der hDFSCs.

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Discussion

Adulte Stammzellen sind derzeit im Fokus für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen. Vor allem Knochenmark (BM)-Stammzellen, einschließlich hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) abgeleitet und MSCs, intensive klinische Untersuchung47unterliegen. Allerdings BM Ernte ist ein invasives Verfahren verursachen Schmerzen an der Stelle der Spende und kann zu unerwünschten Ereignissen48führen. Vor kurzem hat die postnatale Zahngewebe eine neuartige und leicht zugängliche Quelle für Stammzellen entwickelt. Diese zahnmedizinische Stammzellen wurden gezeigt, dass alle MSC Eigenschaften erfüllen und zeigte höheren Verbreitung Kapazität als BM Stammzellen49. Hier haben wir ein detailliertes Protokoll für die Extraktion, Charakterisierung und Entwicklung von hDFSCs vorgestellt.

Die beschriebenen Isolierung Verfahren hat auf menschliche zahnmedizinische Follikel der Weisheitszähne, entwickelt, dieses Gewebe ist allgemein extrahiert und als medizinischer Abfall19entsorgt. Dennoch können andere Zahngewebe, einschließlich der Zahnpulpa50,51, Wurzelhaut52, abgestoßene Milchzähne53und Wurzel apikalen Papille54, für die Gewinnung von dental Stamm genutzt werden Zellen.

Gentechnische Veränderung von Stammzellen durch Einfügen von MiRs ist eine neuartige Strategie um bestimmte Schwierigkeiten in stammzellbasierte Therapien, wie z. B. geringe Stammzellen überleben43,55,56,57. Dieses Protokoll präsentiert wichtige Anweisungen für die effiziente Einführung der synthetischen MiR in hDFSCs mit handelsüblichen kationischen Lipid-basierte Transfection Reagens. Die Anwendung der kationischen liposomalen Formulierungen für die Lieferung von therapeutischen Reagenzien, wie Drogen und Nukleinsäuren, wurde in zahlreichen klinischen Studien58,59untersucht. Allerdings sind kationische Liposomen potentiell zytotoxischen in einer Dosis-abhängigen Weise von Schäden wie z.B., an der Integrität der Zellmembran oder Veränderungen im gen Ausdruck59,60,61 . Toxische Wirkungen auf Zellen induziert durch Transfektion muss daher besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden.

Angegebenen Transfektion Bedingungen wurden optimiert, vor allem, für die MiR vermittelte genetische Veränderung des hDFSCs in Bezug auf Effizienz und Zytotoxizität. Dennoch zeigten andere Studien die erfolgreiche Anwendung von diesem Transfection Reagens für die Lieferung von zusätzlichen Nukleinsäuren, einschließlich Plasmid DNA, mRNA und SiRNA, in andere Zelle Arten62,63, 64 , 65 , 66 , 67 , 68. Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass ideale Lieferbedingungen erheblichen Schwankungen unterworfen und müssen für jeden Zelltyp definiert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das FORUN-Programm von Rostock University Medical Center (889018) und der feuchten Foundation (2016-11) unterstützt. Darüber hinaus ist Uhr und r.d. werden durch das BMBF (VIP + 00240) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA1557A488 Clone SN6, monoclonal
Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 Bio-Rad MCA928A488 monoclonal
APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody BD Biosciences 559883 Clone MAR4, monoclonal
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555751 Clone MOPC-21, monoclonal
PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody BD Biosciences 550257 Clone AD2, monoclonal
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 555749 Clone MOPC-21, monoclonal
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody BD Biosciences 339217 Clone 104D2, monoclonal
PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 557872 Clone MOPC-21, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody BD Biosciences 560531 Clone G44-26, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 558304 Clone 27-35, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody BD Biosciences 561557 Clone 5E10, monoclonal
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 55095 Clone MOPC-21, monoclonal
V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody BD Biosciences 560777 Clone HI30, monoclonal
V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody BD Biosciences 560787 Clone X40, monoclonal
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec 130-059-901
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-020 0.5M, pH 8.0
Steritop Merck Millipore SCGPT05RE 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone
BSA Sigma-Aldrich A7906
PFA Merck Millipore 1040051000
Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R&D Systems SC006
RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fisher Scientific AM9780
Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17120 5 nmol
Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Thermo Fisher Scientific AM17110 5 nmol
Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055 polyclonal
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 polyclonal
Mounting medium; Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML histology mounting medium
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Zeiss
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
ZEN2011 software Zeiss
Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) Biochrom L2143 in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
PBS (1x) Thermo Fisher Scientific 10010023 pH: 7.4; w/o: Ca and Mg
P-S-G (100x) Thermo Fisher Scientific 10378016
Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Thermo Fisher Scientific 11039021
Antibiotic, ZellShield Biochrom W 13-0050
FBS Thermo Fisher Scientific 10500064
Collagenase type I Thermo Fisher Scientific 17100017
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm Braun 4099206
50 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,547,254
15 mL conical centrifuge tube Sarstedt 62,554,502
Cell culture flask 75 cm2 Sarstedt 833,910,002
Cell culture flask, 25 cm2 Sarstedt 833,911,002
Freezing medium, Biofreeze Biochrom F 2270
Cryotubes Thermo Fisher Scientific 377267 1.8 mL
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154 0.4 %
Counting chamber Paul Marienfeld
Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% Mibe
NaCl solution Braun 0.9 %
Vicryl satures, Vicryl rapide Ethicon 3 - 0

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Müller, P., Ekat, K., Brosemann, A., Köntges, A., David, R., Lang, H. Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58089, doi:10.3791/58089 (2018).

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