Summary
ويرد هنا بروتوكولا للتحقيق المبكر آثار اميلويد بيتا (Aβ) في الدماغ. وهذا يبين أن يستحث Aβ الالتقام كلاثرين بوساطة وانهيار النمو محواري الأقماع. البروتوكول مفيد في دراسة آثار Aβ المبكر على النمو محواري الأقماع وقد تسهل الوقاية مرض الزهايمر.
Abstract
اميلويد-بيتا (Aβ) أسباب ضعف الذاكرة في مرض الزهايمر (AD). على الرغم من أن قد ثبت المداواة لخفض مستويات Aβ في أدمغة المرضى الإعلانية، هذه لا تحسين وظائف الذاكرة. استهداف Aβ منذ Aβ المجاميع في الدماغ قبل ظهور ضعف الذاكرة، قد تكون غير فعالة لعلاج مرضى الإعلان الذي يحمل الفعل العجز في الذاكرة. ولذلك، يجب أن يتم حظر مما يشير إلى المصب بسبب ترسب Aβ قبل وضع الإعلان. يستحث Aβ تنكس محواري، مما أدى إلى تعطل شبكات الخلايا العصبية وضعف الذاكرة. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات على آليات سمية Aβ، مصدر سمية Aβ لا يزال غير معروف. للمساعدة في تحديد المصدر، فإننا نقترح رواية بروتوكول يستخدم الفحص المجهري والجينات تعداء وخلية يعيش التصوير إلى التحقيق المبكر التغييرات الناجمة عن Aβ في الأقماع محواري نمو الخلايا العصبية مثقف. وكشف هذا البروتوكول أن Aβ الناجم عن الالتقام كلاثرين بوساطة في النمو محواري الأقماع تليها انهيار مخروط النمو، مما يدل على أن تثبيط الالتقام يمنع السمية Aβ. هذا البروتوكول سوف تكون مفيدة في دراسة آثار Aβ المبكر وقد يؤدي إلى علاج الإعلانية أكثر كفاءة والوقائية.
Introduction
الودائع اميلويد-بيتا (Aβ) توجد في الدماغ للمرضى الذين يعانون من مرض الزهايمر (AD) وتعتبر سببا حرجة الإعلانية1 التي تعطل الشبكات العصبية، مما يؤدي إلى الذاكرة العاهات2،،من34. أظهرت العديد من العقاقير السريرية المرشحين منع بشكل فعال إنتاج اميلويد-بيتا (Aβ) أو إزالة رواسب Aβ. ومع ذلك، أي نجحت في تحسين وظيفة الذاكرة في الإعلان المرضى5. Aβ الفعل يترسب في الدماغ قبل ظهور ضعف الذاكرة6؛ ولذلك، انخفاض مستويات Aβ في أدمغة المرضى ضعف العارضة في الذاكرة قد تكون غير فعالة. الترسب Aβ موجود في السريري الإعلانية المرضى؛ ومع ذلك، نادراً ما هؤلاء المرضى الحالية مع العصبية تفسخ وذاكرة العجز6. وهناك فارق زمني بين الترسيب Aβ وضعف في الذاكرة. لذلك، يتم حظر استراتيجية بالغة الأهمية لمنع الإعلانات سمية Aβ الإشارات خلال المراحل الأولى من الإعلان، قبل وضع العجز في الذاكرة. يستحث ترسب Aβ إكسون تنكس7،8،9،10،11،،من1213، مما قد يؤدي إلى حدوث اضطراب في الشبكات العصبية والإعاقة الدائمة لوظيفة الذاكرة. وحققت العديد من الدراسات آليات Aβ السمية؛ على سبيل المثال، أظهرت محاور عصبية تحولت من أدمغة الفئران الإعلانية زادت أوتوفاجي14. ذكر Calcineurin التنشيط كآلية ممكنة ل Aβ الناجم عن تنكس محواري15؛ ومع ذلك، المشغل مباشرة من تنكس محواري لا يزال غير معروف.
وتركز هذه الدراسة على انهيار النهايات محواري يسمى الأقماع النمو. يمكن أن يكون سبب انهيار النمو محواري الأقماع طاردات محواري النمو، مثل سيمافورين-3A و A5 إفرين16،17،18،،من1920. مثل انهيار النهايات محواري تندب لوحظت في أدمغة الإعلانية المرضى،من21إلى22. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تثير عدم الأداء مخروط النمو تنكس محواري23. بيد أنه غير معروف ما إذا كان يدفع Aβ انهيار مخروط النمو. ولذلك، تقدم هذه الدراسة وضع بروتوكول رواية لمراقبة آثار Aβ المبكر في استزراع الخلايا العصبية، والتحقيق في انهيار المخروط Aβ الناجم عن النمو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في حرم جامعة توياما سوجيتاني ووافقت عليها اللجنة لرعاية الحيوان واستخدام الحيوانات المختبرية في حرم سوجيتاني جامعة من توياما (A2014INM-1، A2017INM-1).
1-انهيار الإنزيم
- طلاء بولي-د-يسين
- معطف الشرائح الثقافة 8-جيدا مع 400 ميكروليتر من 5 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين (PDL) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) واحتضانها لهم عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة الحل PDL وغسل الآبار 3 مرات بماء مقطر.
- ثقافة العصبية24
- فرم كورتيسيس الدماغي معزولة طازجة من اليوم الجنينية 14 الفئران دي (E14) مع ميكروسسيسورس في المتوسط الثقافة الخلايا العصبية التي تحتوي على مصل الحصان 12% والسكر 0.6% 2 مم L-الجلوتامين (متوسط). لا تقم بإضافة المضادات الحيوية.
ملاحظة: في هذا البروتوكول، ويتم استخدام الماوس دي. وهذا عبئا أووتبريد استخداماً في اليابان. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول ثقافة العصبية للفئران الخلايا العصبية القشرية7،25. - الطرد المركزي الأنسجة في 87 س ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية. ثم بيليه، إضافة 2 مل التربسين 0.05% واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. مزيج من التنصت على كل 5 دقائق.
- إضافة 4 مل أ المتوسطة ومزيج من التنصت.
- الطرد المركزي الأنسجة في 178 س ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية، واحتضان الأنسجة مع 600 U/mL الدناز أنا و 0.3 مغ/مل فول الصويا التربسين مثبط حله في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. مزيج من التنصت على كل 5 دقائق.
- بعد الحضانة، إضافة 4 مل أ المتوسطة والمزيج عن طريق التنصت.
- الطرد المركزي الأنسجة في 178 س ز لمدة 3 دقائق.
- بعد إزالة المادة طافية، إضافة 4 مل متوسط وتريتوراتي الأنسجة مع ماصة باستور مصقول.
- تصفية الأنسجة يسحق مع حجم مسام 70 ميكرون. وبعد الترشيح، وحساب كثافة الخلايا التي تحتوي هيموسيتوميتير.
- ثقافة الخلايا في الثقافة 8-جيدا الشريحة في 0.8 × 104 خلايا/جيدا مع متوسط والمحافظة عليها في حاضنة2 CO مع جو هوميديفيد من 10% CO2 في 37 درجة مئوية.
- بعد 4 ح لاستزراع، يستعاض عن المتوسط الثقافة إلى الملحق 2% تحتوي على واحد لثقافة العصبية والسكر 0.6% 2 مم L-الجلوتامين (المتوسطة ب).
ملاحظة: نقاء الخلايا العصبية وكان حوالي 75%، كما هو موضح سابقا26.
- فرم كورتيسيس الدماغي معزولة طازجة من اليوم الجنينية 14 الفئران دي (E14) مع ميكروسسيسورس في المتوسط الثقافة الخلايا العصبية التي تحتوي على مصل الحصان 12% والسكر 0.6% 2 مم L-الجلوتامين (متوسط). لا تقم بإضافة المضادات الحيوية.
- انهيار المقايسة27
- حل تجارياً الحصول على كامل طول اميلويد β1-42 (Aβ1-42) في الماء المقطر في تركيز من 0.5 مم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. بعد الاحتضان، تخزين الحل Aβ1-42 مجمعة في ثلاجة-30 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: هذه الحضانة ضروري للتجميع وسمية Aβ27،28،،من2930. - بعد 4 أيام ثقافة العصبية، معالجة الآبار مع 100 ميكروليتر من جديد ب المتوسطة، التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر تجميعه حل Aβ1-42 أو مركبة (الماء المقطر) ح 1.
ملاحظة: آثار Aβ1-42 كانت الجرعة [دبندنتلي] زيادة من 0.1 إلى 5 ميكرومترات، وبلغت ذروتها في 0.5 ميكرومتر كما هو موضح سابقا إلى27. ويمكن ملاحظة نتائج مماثلة عندما بالعلاج Aβ1-42 ح 1 بعد 3 أيام من ثقافة العصبية31. - إزالة متوسط الثقافة ومباشرة إصلاح الخلايا العصبية مع بارافورمالدهيد 4% يحتوي على السكروز 4% في برنامج تلفزيوني عن ح 1 في 37 درجة مئوية على طبق ساخن.
- بعد التثبيت، تغسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وجبل لهم مع وسيط مائي متصاعدة. الجافة المتوسطة المتصاعد في 4 درجة مئوية لمدة 2 – 4 أيام.
- التقاط منطقة بأكملها (7.8 × 9 مم2) لكل بئر مع عدسة هدف جاف X 20 في مجهر مقلوب.
- تصنيف نيوريتيس أطول من كل الخلايا العصبية في المرحلة 3 أو 4 كمحاور عصبية، كما هو موضح سابقا32،33.
- تصنيف الأقماع النمو وفقا للمعايير التالية: النمو 1) محواري الأقماع تعتبر تفتقر إلى لاميليبوديا أو 2) حيازة فيلوبوديا أقل من ثلاثة أنهار الأقماع النمو، كما هو موضح سابقا17.
ملاحظة: سجل النمو الصحي والأقماع 0 نقطة؛ وسجل النمو المنهار والأقماع كنقطة واحدة. يعني انهيار عشرات تحسب لكل معاملة.
- حل تجارياً الحصول على كامل طول اميلويد β1-42 (Aβ1-42) في الماء المقطر في تركيز من 0.5 مم واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. بعد الاحتضان، تخزين الحل Aβ1-42 مجمعة في ثلاجة-30 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2-اميلويد بيتا إيمونوستينينج
- الثقافة الماوس القشرية الخلايا العصبية لمدة 3 أيام، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- تعامل مع المجمعة Aβ1-42 (5 ميكرومترات) أو مركبة ح 4 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
- دون إزالة المتوسطة، إضافة وحدة تخزين متساوية من 4% بارافورمالدهيد تحتوي على السكروز 4% في برنامج تلفزيوني لكل بئر، والحفاظ على الثقافة في 37 درجة مئوية على صفيحة ساخنة لمدة 5 دقائق.
- استبدال الحل مع 400 ميكروليتر من بارافورمالدهيد 4% يحتوي على السكروز 4% في برنامج تلفزيوني، والحفاظ على 37 درجة مئوية في صفيحة ح 1. تعديل لهذا البروتوكول تثبيت من تقرير سابق34.
- تغسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- كتلة مع مصل الماعز العادي 5% في برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا العصبية مع الماوس بيتا اميلويد المضادة غلوبيولين مناعي G (IgG) (01:50) والبومين المصل البقري 1% في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تغسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا العصبية بجسم الثانوي مترافق الأسفار (1: 400) والبومين المصل البقري 1% في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة ح 2.
- تغسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وجبل لهم مع وسيط مائي متصاعدة.
- التقاط fluorescence الصور والصور الميدانية مشرق مع الإضاءة المائلة باستخدام عدسة هدف جافة 40 س في المجهر المقلوب باء
3-محواري إيمونوستينينج27
- غسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني بعد العصبية مثقف التثبيت، كما هو موضح في الخطوة 1.3.3.
- احتضان الخلايا العصبية مع الماوس المضادة تو 1 مفتش (1: 500)، الأرنب microtubule المضادة البروتين المرتبط 2 (MAP2) IgG (1: 500) في مصل الماعز العادي 5%، ونسبة 0.3% t-أوكتيلفينوكسيبولي-اثوكسييثانول في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تغسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا العصبية مع مترافق fluorescence الأجسام المضادة الثانوية (1: 400) و 0.3%-أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول تيفي برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة ح 2.
- تغسل الخلايا العصبية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، وجبل استخدام وسيلة متزايدة مائي.
- التقاط صور التباين (DIC) تدخل الأسفار والتفاضلية باستخدام عدسة هدف 20 × جافة على ألف المجهر المقلوب
4-يعيش خلية التصوير27
- معطف المستندة إلى الزجاج الأطباق مع 500 ميكروليتر من PDL (5 ميكروغرام/مل)، كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
ملاحظة: استخدمت في هذا البروتوكول، أطباق محلية الصنع على الزجاج. أطباق المستندة إلى الزجاج المتاحة تجارياً يمكن استخدامها أيضا لتصوير حية. تم إعداد أطباق محلية الصنع على الزجاج على النحو التالي: 1) جعل ثقب حوالي 1.4 ملم في القطر في وسط صحن 35 ملم لكمه يد، و 2) أرفق زجاج ساترة (قطر 22 مم) إلى الجزء الخلفي الطبق مع سيليكون. - غسل الأطباق بالماء المقطر، كما هو موضح في الخطوة 1.1.2، والثقافة الخلايا العصبية القشرية في الطبق على الزجاج في 3 × 104 خلايا/طبق أ متوسطة، كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- بعد 4 أيام زراعة الخلايا، استبدال المتوسطة مع 2 مل متوسطة الجديدة ب، ونقل الطبق بالمقلوب مجهر أ المحافظة على الثقافة في جو هوميديفيد من 10% CO2 في 37 درجة مئوية.
5-الالتقام التجربة
- ثقافة الخلايا العصبية القشرية الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- بعد أربعة أيام، يستبدل المتوسطة 100 ميكروليتر من المتوسطة الجديدة ب الذي يحتوي على 20 ميكرو fluorescence غشاء المسبار لمدة 1 دقيقة.
- إضافة ميكروليتر 1 0.05 مم المجمعة Aβ1-42 (النهائي 0.5 ميكرومتر) أو مركبة (الماء المقطر) الحل ومزيج من بيبيتينج. احتضان لمدة 20 دقيقة.
- إزالة المتوسطة وغسل الآبار مرتين مع المتوسطة ب الذي تم مسبقاً المعالجون إلى 37 درجة مئوية.
- فيكس وغسل وجبل الخلايا العصبية كما هو موضح في الخطوات 1.3.3 و 1.3.4.
- التقاط الفلورسنت والصور DIC مع 63 X عدسة هدف النفط على ألف المجهر المقلوب
- قياس كثافة منطقة مصابات بمسبار غشاء الأسفار في كل مخروط النمو الصحي باستخدام برنامج صور.
6-جين تعداء
- إعداد الخلايا العصبية القشرية كما هو موضح في الخطوة 1.2. بعد إكمال الخطوات 1.2.1 إلى 1.2.10، الطرد المركزي الخلايا العصبية في 178 س ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية، إضافة 4 مل من Ca2 +-الحرة و Mg2 +-الحرة هانكس الملح حل متوازن (مركز المرأة والأسرة-حبس)، ومزيج من بيبيتينج.
- الطرد المركزي الخلايا في 178 س ز لمدة 3 دقائق.
- إزالة المادة طافية وإضافة 4 مل من مركز المرأة والأسرة-هبس، ومزيج من بيبيتينج. وبعد ذلك، حساب كثافة الخلية، كما هو موضح في الخطوة 1.2.10.
- نقل 5 × 106 خلايا إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,677 س ز لمدة 1 دقيقة.
- إزالة المادة طافية وإضافة 100 ميكروليتر من تعداء الحل مع الملحق وميكروغرام 3 من الحمض النووي بلازميد ترميز اجفب أو اجفب-AP180 ج-المحطة، ومزيج من بيبيتينج.
- نقل الحل أعلاه (الخطوة 6.6) إلى ومبومو مصدقة وترانسفيكت مع اليكتروبوراتور، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- فور تعداء، إضافة 500 ميكروليتر من متوسط إلى ومبومو ونقل الحل إلى أنبوب 1.5 مل مع ماصة مصدقة. وبعد ذلك، حساب كثافة الخلية، كما هو موضح في الخطوة 1.2.10.
- ثقافة الخلايا في شريحة ثقافة 8-جيدا في 0.8 × 104 خلايا/حسنا، كما هو موضح في الخطوات 1.2.11 و 1.2.12.
- بعد 4 أيام زراعة الخلايا، القيام مقايسة انهيار كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول، المحتضنة Aβ1-42 في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام قبل الاستخدام، لأن الحضانة من Aβ1-42 ضروري لإنتاج أشكال السامة27،28،،من3035. وبعد هذا الاحتضان، لوحظت مجمعة أشكال Aβ (الشكل 1A). وأفيد أن حضانة مماثلة من Aβ1-42 أنتج شكل فيبريل Aβ36. بعد العلاج مع هذه المجمعة Aβ1-42، أنجز إيمونوستينينج مع جسم مضاد للسمية أوليجومير35،Aβ37 ، وتلطيخ إيجابية تم اكتشاف على استزراع الخلايا العصبية (الشكل 1B). في ضوء ما سبق، ينتج هذا البروتوكول الحضانة بأشكال Aβ السامة.
عدة أيام كانت مطلوبة من أجل استحثاث تنكس محواري بعد التعرض Aβ. الأحداث التي وقعت قبل تنكس محواري لا تزال غير واضحة. ولذلك وضعت هذا البروتوكول لزيادة فهم الآليات التي ينطوي عليها. باستخدام هذا البروتوكول، تم تحليل الظواهر المبكرة الناجمة عن العلاج Aβ. تم استزراع الخلايا العصبية القشرية لمدة 4 أيام. واعتبرت نيوريتيس أطول في الخلايا العصبية مثقف محاور عصبية؛ وأكدت هذه إيمونوستينينج إيجابية لعلامة محواري وتأو-1، وإيمونوستينينج السلبية لعلامة الجذعية، MAP2 (الشكل 2). بعد ح 1 مركبة في المعاملة، قد انتشرت لاميليبوديا الأقماع النمو ومعالجة فيلوبوديا عدة. واعتبرت هذه الأقماع النمو الصحي. على العكس من ذلك، ح 1 من العلاج Aβ1-42 أدت إلى نمو منكمش الأقماع، التي وضعت لا لاميليبوديا أو فيلوبوديا. واعتبرت هذه النمو المنهار والأقماع. وقد حسبت عشرات انهيار كما هو موضح في الخطوة 1.3.7. عندما أشكال الأقماع النمو غير واضحة، أنها أزيلت من التحليل. العلاج Aβ1-42 أدت إلى زيادة كبيرة في درجة الانهيار، المقابلة لزيادة انهيار النمو محواري، عند مقارنتها بالنتيجة انهيار النمو المعالجة بالمركبات والأقماع27.
ولوحظ نمو محواري الأقماع قبل وبعد العلاج مع Aβ1-42 (الشكل 3). وأبقى على الخلايا في المجهر المقلوب مع جو هوميديفيد من 10% CO2 في 37 درجة مئوية. تم القبض على الصور كل 5 دقائق. كما هو موضح في الشكل 3، أنهار الأقماع النمو بين 21 و 26 دقيقة بعد العلاج Aβ1-42. النمو والأقماع استبعدت من خلية حية التصوير لو أنهم لم يحتفظوا بشكلها السليم ح 1 قبل أي علاج.
واستخدمت الالتقام لتصور آثار Aβ1-42-العلاج المبكر، كمحور لهذا التحليل، نظراً الالتقام مثبطات يمكن منع انهيار مخروط النمو الناجم عن Aβ1-4227. كان تصور الالتقام مع تحقيق غشاء الأسفار (أي.، صبغة فلورسنت التي تلزم للأغشية البلازمية وعفويا المبتلعة). وأظهرت دراسة سابقة أن الأقماع النمو لا ينهار في 20 دقيقة بعد27من Aβ1-42-العلاج؛ ولذلك، قد اختارت النمو الصحي والأقماع DIC التصوير في السيارة-أو Aβ1-42-تعامل الخلايا بعد 20 دقيقة. وعقب Aβ1-42-العلاج، لوحظت غشاء الفلورسنت عديدة إيجابية التحقيق بونكتا في مخروط النمو (الشكل 4). كثافة fluorescence غشاء مصابات بمسبار بونكتا في النمو والأقماع كان إلى حد كبير زيادة27. وهذا يوحي بأن الالتقام مخروط النمو الناجم عن Aβ1-42 يحدث قبل انهيار.
لتأكيد دور الالتقام، وكان transfected بلازميد الحمض النووي ترميز اجفب-AP180 ج-تيرمينوس في الخلايا العصبية القشرية مثقف. تثبيط الخلايا معربا عن AP180 ج-المحطة بشكل انتقائي38،كلاثرين بوساطة الالتقام39. إذا لوحظ التعبير اجفب في جسم الخلية في الخلايا العصبية اعتبرت AP180 ج-المحطة الإعراب في مخروط النمو محواري من الخلايا العصبية. تعداء AP180 ج-تيرمينوس منعت النمو الناجم عن 42 Aβ1 مخروط انهيار (الشكل 5)27.
الشكل 1 : حضانة من (أ) Β1-42 المجاميع Aβ. (A) Aβ1-42 كان يذوب في الماء المقطر في تركيز من 0.5 مم والمحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام (بعد الحضانة)، أو تخزينها عند-30 درجة مئوية دون الحضانة (لا الحضانة). وقد تضعف كل حل Aβ إلى 0.1 مم؛ ثم أسقطت على الشرائح الزجاجية 10 ميكروليتر من كل حل المخفف ومغطاة كوفيرسليبس. تم القبض على الصور الميدانية برايت مع الإضاءة المائلة باستخدام المجهر المقلوب الجدول باء بار = 20 ميكرومتر. (ب) العلاج Aβ1-42 مجمعة أو المركبات في الخلايا العصبية مثقف ح 4. وبعد العلاج، تم إصلاح الخلايا العصبية وإيمونوستينيد للسمية Aβ ليغومرات. الصور الفلورية (أحمر) وتظهر صور مشرقة الميدانية مع الإضاءة المائلة (رمادي). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : A انهيار مخروط النمو محواري β1-42-فعل- بعد العلاج Aβ1-42 أو مركبة، كانت ثابتة من الخلايا العصبية والمرتبطة إيمونوستينيد تاو-1 (أحمر) و microtubule البروتين 2 (MAP2، الأخضر). تظهر الصور التباين (DIC) تدخل الأسفار والتفاضلية. فيما يلي آراء تضخيم المناطق من الفائدة (العائد على الاستثمار، ومستطيلات) الصور المقابلة الخاصة بهم. الأبيض أشرطة مقياس = 50 ميكرومتر؛ أسود أشرطة مقياس = 10 ميكرومترات. لقد تم تعديل هذا الرقم من كوبوياما et al,27من عام 2015. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : يعيش تصوير الخلية قبل وبعد المعاملة β1-42- بعد 4 أيام ثقافة، نقل الخلايا إلى مجهر مقلوب، وتم القبض على الصور DIC كل دقيقة 5 تظهر الوقت الفاصل بين الصور. تمثل الأرقام دقائق: ثوان بعد تطبيق المجمعة Aβ1-42 (التركيز النهائي، 0.5 ميكرومتر). شريط المقياس = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : عشرين دقيقة أ المعاملة β1-42 التي يسببها الالتقام. الخلايا العصبية القشرية مثقف لمدة 4 أيام وتعامل مع تحقيق غشاء الأسفار. ثم، كانت تعامل الخلايا العصبية لمدة 20 دقيقة مع Aβ1-42 أو مركبة. تظهر الصور الأسفار من الأقماع النمو. وتمثل الخطوط المنقطة الأصفر الخطوط العريضة الأقماع النمو. شريط المقياس = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : التعبير عن محطة AP180-C يمنع الانهيار الناجم عن Aβ1-42- أربعة أيام بعد تعداء اجفب (أ، ب) أو اجفب-AP180 ج-المحطة (ج، د)؛ Aβ1--42 (ب، د) أو مركبة (أ، ج) وأضيفت إلى الخلايا العصبية القشرية حاء 1 DIC (لوحات العلوي)، وتظهر الصور الفلورية (الألواح السفلي). تشير الأسهم إلى النمو والأقماع. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمكين البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة رصد الظواهر المبكرة في نمو محواري الأقماع بعد العلاج Aβ1-42. Aβ1--42 التي يسببها الالتقام في الأقماع محواري النمو خلال 20 دقيقة، ولوحظ انهيار مخروط النمو ضمن ح 1 من العلاج. وقد توسط هذا الالتقام ربما كلاثرين. باستخدام هذا البروتوكول، أكد تثبيط الالتقام كلاثرين بوساطة لمنع انهيار مخروط النمو الناجم عن Aβ1-42 وتنكس محواري في الخلايا العصبية مثقف27. بالإضافة إلى ذلك، يخفف تثبيط الالتقام كلاثرين بوساطة تنكس محواري Aβ1-42-المستحث والعجز في الذاكرة في فيفو27. هذه النتائج تشير إلى أن الالتقام كلاثرين بوساطة واعدة علاجية لمنع الإعلانات.
تم تطوير هذا البروتوكول من انهيار فحوصات طاردات محواري النمو، مثل سيمافورين 3A و A5 إفرين16،17،18،،من1920. وقد استخدمت فحوصات انهيار في دراسات تقييم تطوير الشبكات العصبية. لقد أظهرت أنه يمكن تطبيق هذا البروتوكول على التحليلات المرضية، لا سيما تلك التي تنطوي على آليات للإعلان؛ ومع ذلك، قد يكون القيد أن حوالي 40 في المائة من النمو والأقماع أنهار في حالة صحية جيدة. وهذه النسبة المئوية أعلى من النتائج من مثقف الظهرية جذر العقدة العصبية، التي أكثر شيوعاً في طي فحوصات16،،من1718،،من1920. ولذلك، قد تكون مرتبطة الفرق في أنواع الخلايا بالاختلافات في نسب انهيار. أن انهيار نسب وجدت في هذه الدراسة كانت متسقة مع تلك التي عثر عليها في الدراسات السابقة مع الخلايا العصبية القشرية المستزرعة عادي40،41. وعلاوة على ذلك، Aβ1-42 التي يتسبب فيها مستويات مماثلة من انهيار مخروط النمو بالمقارنة مع عوامل انهيار أخرى، مثل سيمافورين 3A و A5 إفرين27. ولذلك، هذا البروتوكول يكون صالحاً للتحديد الكمي لانهيار مخروط النمو الناجم عن Aβ1-42. هذا البروتوكول التثبيت من المهم الحفاظ على شكل الأقماع النمو. إذا تم إصلاح الخلايا تقليديا مع بارافورمالدهيد 4% عند درجة حرارة الغرفة، قد انهارت أكثر والأقماع النمو بسبب إجراءات التثبيت (البيانات لا تظهر). بدلاً من ذلك، يتم المخازن المؤقتة glutaraldehyde والتثبيت متوفرة للتثبيت جامدة، كما هو موضح سابقا42؛ ومع ذلك، المعارض glutaraldehyde أوتوفلوريسسينسي، ويشكل عقبة كبيرة لتصوير الأسفار.
أظهرت دراسة أجريت مؤخرا مع البروتوكول نفسه أن استخراج المياه من "الرقم الأساسي بوليجالاي" (جذور تينويفوليا بوليجالا) تحول دون الالتقام Aβ1-42-المستحث في استزراع الخلايا العصبية ومنعت تنكس محواري وتخفيض العجز في الذاكرة في نموذج الماوس المحورة وراثيا من الإعلان31. قد تم العثور على مرشح رواية لمنع الإعلانات مع هذا البروتوكول. مزيج من تعداء الجينات وتصوير الخلايا الحية في هذا البروتوكول قد تظهر الأحداث الخلوية الأخرى التي وجدت في محاور عصبية وتلك المحطات قبل وبعد العلاج Aβ، مثل Ca2 + تصوير وديناميات microtubule، وديناميات التصاق الخلية، التي هي النمو يقال أن تتصل محواري43،،من4445. هذا البروتوكول قد تساعد في الكشف عن آليات تفصيلية أكثر Aβ السمية وقد يساعد تؤدي إلى منع و/أو المعالجة للإعلان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل جزئيا بالمنح البحثية من JSPS (كاكينهي 18 ك 07389)، اليابان، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، اليابان، وكوباياشي الصيدلانية المحدودة، اليابان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P.
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
