Modèle robuste induit par la ligature de la parodontite de Murine pour l'évaluation des neutrophiles oraux

Summary

Cet article présente un protocole pour établir un modèle ligature-induit de la parodontite de murine impliquant les molaires maxillaires multiples, ayant pour résultat de plus grandes zones du tissu et de l’os gingival impliqués pour l’analyse suivante aussi bien que l’utilisation animale réduite. Une technique pour évaluer les neutrophiles oraux d’une manière analogue aux sujets humains est également décrite.

Abstract

Les principaux avantages de l’étude de la pathophysiologie de la maladie parodontale en utilisant des modèles murins sont le coût réduit des animaux, l’éventail de souches génétiquement modifiées, le grand nombre d’analyses qui peuvent être effectuées sur les tissus mous et durs récoltés. Cependant, bon nombre de ces systèmes font l’objet de critiques procédurales. Comme alternative, le modèle ligature-induit de la maladie parodontale, conduit par le développement localisé et la conservation d’un microbiome oral dysbiotique, peut être employé, qui est rapidement induit et relativement fiable. Malheureusement, les variantes du protocole de parodontite murine-induite de ligature sont isolées aux régions focales du parodontium et soumises à l’avulsion prématurée de la ligature installée. Cela minimise la quantité de tissu disponible pour les analyses ultérieures et augmente le nombre d’animaux requis pour l’étude. Ce protocole décrit les manipulations précises nécessaires pour placer les ligatures molaires prolongées avec la conservation et l’utilisation améliorées d’une technique de rinçage nouvelle pour récupérer les neutrophiles oraux chez les souris avec une approche alternative qui atténue ce qui précède défis techniques.

Introduction

La maladie parodontale (PD) est une condition ostéolytique liée à la morbidité et au fardeau économique significatifs d’hôte, qui se manifeste par l’inflammation gingivale et la perte de l’attachement mou de tissu et du soutien osseux pour la dentition affectée^1,2,3,4. Ce processus est régi par les interactions entre le microbiote oral et le système immunitaire inné de l’hôte. Il est également associé à l’exacerbation d’autres maladies inflammatoires systémiques, y compris le diabète, les maladies cardiovasculaires, et le cancer^5,6,7,8. Historiquement, on a émis l’hypothèse que la pathogénie de la dépend de grandes quantités de bactéries spécifiques telles que Porphyromonas gingivalis⁹. Cependant, des preuves récentes suggèrent que la composante microbienne de la est médiée par le biofilm dentaire. Le biofilm est une communauté organisée et complexe de nombreux micro-organismes qui peuvent exister dans des états dysbiotiques sains et dysbiotiques destructeurs^10,11. Le biofilm oral offre normalement une résistance à l’hôte en empêchant l’établissement de foyers de bactéries pathogènes et favorise la structure et la fonction idéales des tissus gingivals par la régulation de la réponse immunitaire de l’hôte^12,13. Perturbations de la relation equilibrious entre les organismes commensal dans la cavité buccale et le système immunitaire hôte peut conduire à des altérations de l’homéostasie tissulaire, entraînant une dysbactériose et le développement des apparences cliniques et radiographiques caractéristiques de^{5,10,12,13,14}.

Fait intéressant, l’établissement d’une dysbactériose orale, bien que nécessaire pour l’initiation de la DP, n’est pas suffisant pour conduire la DP chez tous les individus, fuyant vers la capacité de la réponse immunitaire hôte à subvertir la transition du microbiote entre les états symbiotiques et dysbiotiques¹⁵. Cela met en lumière les moyens par lesquels la Mpd influence l’un des personnages principaux du système immunitaire inné, à savoir le granulocyte polymorphonucléaire (PMN), ou neutrophile, du point de vue local et systémique^16,17.

Chez l’homme, les PMN sont recrutés à partir de la circulation à un taux de 2 x 10⁶ cellules/h dans les tissus conjonctifs parodontaux sains, où ils sont la population prédominante de leucocytes. Ici, ils sont ensuite expulsés du sulcus gingival dans la cavité buccale comme un composant du liquide creviculaire gingival. En présence de La DP, la neutrophilie se manifeste dans la circulation et la cavité buccale, où ces cellules effectrices possèdent un phénotype hyperinflammatoire qui conduit à la destruction susmentionnée du parodontium^17,18,^19,20,21,22. Par conséquent, la compréhension du rôle des PMN dans la MP et d’autres conditions inflammatoires systémiques est de la plus haute importance.

Bien qu’il soit largement admis que les maladies chroniques sont réciproquement liées à la MALADIE, les mécanismes sous-jacents n’ont pas encore été élucidés, contribuant à des difficultés dans la gestion de ces conditions systémiques morbides et potentiellement mortelles. Plusieurs modèles animaux expérimentaux, chacun avec des avantages et des inconvénients uniques, ont été utilisés pour étudier la physiopathologie de la^23,24. En se concentrant spécifiquement sur les modèles murins, il existe une variété de protocoles par lesquels l’étude de la DP est facilitée; cependant, ils possèdent plusieurs défauts techniques et physiologiques^{25,26,27,28,29,30,31}.

Tout d’abord, le modèle oral de souris de gavage exige de nombreuses inoculations orales des pathogènes parodontaux humains pour produire l’inflammation gingivale et la perte d’os. En outre, il est généralement précédé d’une période de traitement antibiotique pour subvertir la flore buccale murine commensal²⁵. Ce modèle nécessite souvent une formation spécialisée pour effectuer en toute sécurité le gavage oral, n’utilise qu’une petite fraction des pathogènes parodontaux du microbiome oral humain plus complexe, et nécessite plusieurs mois pour établir la perte osseuse alvéolaire.

En revanche, les modèles murines induits chimiquement utilisent la livraison orale de l’acide sulfonique de trinitrobenzene (TNBS) ou du sodium de sulfate de dextran (DSS), agents couramment employés en établissant des modèles murins de colite sur une période de plusieurs mois pour induire la perte parodontale d’os^26. Des modèles intraoraux et extraoraux à base d’abcès sont disponibles, qui impliquent les inciseurs et les tissus murines du dorsum ainsi que le calvarium, respectivement. Dans l’ancien modèle d’abcès, plusieurs injections de bactéries sont administrées, créant de multiples abcès gingivals et une pénurie de perte osseuse alvéolaire, limitant leur utilisation dans l’étude de la. Ces derniers modèles d’abcès sont significativement plus aptes à étudier la virulence bactérienne, l’inflammation, et la résorption osseuse à des emplacements en dehors de la cavité buccale, ce qui élimine l’évaluation du parodontium et du microbiome oral^{27,28,29,30,31}.

Utilisant le modèle de la parodontite induit par ligature, une suture de soie tressée a été généralement installée circonfèrement autour de la deuxième molaire. Comme alternative, un seul segment linéaire de matériau de suture peut être inséré entre la première et la deuxième molaire^32,33. Le but du placement de ligature est de faciliter l’accumulation bactérienne et de générer la dysbiose dans le sulci gingival, ayant pour résultat l’inflammation parodontale de tissu et la destruction des tissus composant le parodontium. Plus particulièrement, ce modèle est capable de produire beaucoup plus de perte osseuse alvéolaire par rapport au modèle de gavage oral plus couramment utilisé³⁴. La résistance naturelle de plusieurs souches de souris (c.-à-d. C57BL/6) au développement de la perte osseuse alvéolaire complique encore davantage l’utilisation du modèle de gavage oral. C’est également problématique, car cette souche est la plus fréquemment utilisée dans la recherche animale à base de murine³⁵.

Les procédures existantes décrites par Marchesan et coll. et Abe et Hajishengallis ont été conçues pour simplifier l’acte technique de placer la ligature^33,36. Malheureusement, l’ancien protocole exige de l’équipement spécialisé imprimé en 3D et possède le potentiel de perte prématurée de ligature, augmentant ainsi l’utilisation des animaux et les coûts associés au temps supplémentaire passé dans la salle d’opération. En outre, les deux protocoles ne génèrent que de petites régions du parodontium malade disponibles pour une étude.

Les avantages qui se trouvent avec cette technique sont fondés sur l’étude simultanée de la dysbiose orale et l’immunologie qui régissent le parodontium, l’utilisation d’animaux à faible coût avec des antécédents génétiques divers, et les pratiques simples de logement et d’élevage. En tant que tel, les objectifs devraient être de maximiser les volumes de tissus malades et, dans les tentatives de pratiquer les principes de réduction de la recherche animale, de réduire la consommation animale à un niveau aussi bas que possible. Pour ce faire, il faut s’assurer que tous les animaux sont capables d’être inclus dans les analyses expérimentales³⁷. Cependant, il convient de noter que peu importe quel modèle animal de la maladie parodontale est utilisé, il n’existe pas de modèle unique qui englobe tous les éléments de la pathophysiologie de la humaine.

Ce nouveau protocole utilise le placement d’une ligature autour de multiples dents molaires maxillaires à l’aide d’instruments et de matériaux que l’on trouve dans la plupart des laboratoires. Il permet une quantité suffisante de temps pour installer facilement et en toute confiance une ligature qui est peu susceptible d’avulse prématurément. Enfin, comme les PMN coordonnent la destruction du parodontium dans la MP, une nouvelle méthodologie pour récupérer les neutrophiles oraux d’une manière analogue à l’homme est également présentée.

Protocol

Toutes les études sur les murines étaient conformes aux règlements éthiques pertinents et ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l’Université de Toronto et le Research Ethics Board (Protocol 20011930). 1. Installation de Ligature REMARQUE: Il s’agit d’une intervention chirurgicale non stérile qui peut être effectuée dans un bloc opératoire standard. L’utilisation d’animaux exempts de germes (non couverts ici) exige la manipulation dans …

Representative Results

Des données représentatives de cytométrie de flux provenant d’échantillons de rinçantoral d’une cavité buccale naïve (figure 3A) et enflammée (figure 3B) de cavité buccale murine secondaire à la parodontite induite par la ligature sont fournies. La récupération des PMN à partir d’une ligature installée est également démontrée (figure 3C). Les tensions de canal de cy…

Discussion

L’élément le plus critique associé à l’utilisation du modèle de la parodontite induit par la ligature murine est centré autour de la rétention de la ligature jusqu’au moment du sacrifice ou de l’ablation intentionnelle. La ligature biofilm-retentive installée est capable d’induire une perte significative de la hauteur alvéolaire d’os en aussi peu que 6 jours, plafonnant entre la période de 11-16 jours^39. La décision de sacrifier les sujets animaux avant la période maximale de perte oss…

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL