Modelo robusto inducido por la ligatura de la periodontitis murina para la evaluación de los neutrófilos orales

Summary

Este artículo presenta un protocolo para establecer un modelo inducido por ligaduras de periodontitis murina que involucre múltiples molares maxilares, lo que resulta en áreas más grandes del tejido gingival y hueso involucrados para su posterior análisis, así como un menor uso de animales. También se describe una técnica para evaluar a los neutrófilos orales de una manera análoga a los sujetos humanos.

Abstract

Las principales ventajas de estudiar la fisiopatología de la enfermedad periodontal utilizando modelos murinos son el menor costo de los animales, la variedad de cepas modificadas genéticamente, el gran número de análisis que se pueden realizar en los tejidos blandos y duros cosechados. Sin embargo, muchos de estos sistemas están sujetos a críticas de procedimiento. Como alternativa, se puede emplear el modelo inducido por la ligatura de la enfermedad periodontal, impulsado por el desarrollo localizado y la retención de un microbioma oral disbiótico, que es rápidamente inducido y relativamente confiable. Desafortunadamente, las variantes del protocolo de periodontitis murina inducida por ligaduras están aisladas en regiones focales del periodontium y sujetas a la avulsión prematura de la ligadura instalada. Esto minimiza la cantidad de tejido disponible para análisis posteriores y aumenta el número de animales necesarios para el estudio. Este protocolo describe las manipulaciones precisas necesarias para colocar ligaduras molares extendidas con una mejor retención y el uso de una técnica de enjuague novedosa para recuperar neutrófilos orales en ratones con un enfoque alternativo que mitiga lo antes mencionado desafíos técnicos.

Introduction

La enfermedad periodontal (PD) es una afección osteolítica asociada a la morbilidad significativa del huésped y la carga económica, que se manifiesta por inflamación gingival y pérdida tanto de la unión de tejidos blandos como de soporte óseo para la dentición afectada^1,2,3,4. Este proceso se rige por interacciones entre la microbiota oral y el sistema inmunitario innato del huésped. También se asocia con la exacerbación de otras enfermedades inflamatorias sistémicas incluyendo diabetes, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer^5,6,7,8. Históricamente, se hipotetizó que la patogénesis PD depende de grandes cantidades de bacterias específicas como Porphyromonas gingivalis⁹. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que el componente microbiano de la DP está mediado por el biofilm dental. El biofilm es una comunidad organizada y compleja de numerosos microorganismos que pueden existir en estados simbióticos sanos y destructivos^10,11. El biofilm oral normalmente ofrece resistencia al huésped al prevenir el establecimiento de focos de bacterias patógenas y promueve la estructura y función ideal del tejido gingival a través de la regulación de la respuesta inmune del huésped^12,13. Las perturbaciones de la relación de equilibrio entre los organismos comensales dentro de la cavidad oral y el sistema inmunitario huésped pueden dar lugar a alteraciones en la homeostasis tisular, lo que resulta en disbacteriosis y al desarrollo de las apariencias clínicas y radiográficas distintivas de PD^{5,10,12,13,14}.

Curiosamente, el establecimiento de una disbacteriosis oral, si bien es necesario para el inicio de la DP, no es suficiente para conducir la DP en todos los individuos, eludiendo hacia la capacidad de la respuesta inmune del huésped para subvertir la transición de la microbiota entre los estados simbióticos y disbióticos¹⁵. Esto pone un foco particular en los medios a través de los cuales la DP influye en uno de los principales caracteres del sistema inmunitario innato, a saber, el granulcito polimorfonuclear (PMN), o neutrófilo, desde perspectivas locales y sistémicas^16,17.

En los seres humanos, las PMN se reclutan de la circulación a una tasa de 2 x 10⁶ células/h en tejidos conectivos periodontales sanos, donde son la población predominante de leucocitos. Aquí, posteriormente son expulsados del sulcus gingival a la cavidad oral como un componente del líquido crevicular gingival. En presencia de DP, la neutrofilia se manifiesta dentro de la circulación y cavidad oral, donde estas células efectoras poseen un fenotipo hiperinflamatorio que conduce a la mencionada destrucción del periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Por lo tanto, comprender el papel de las PMN en la DP y otras condiciones inflamatorias sistémicas es de suma importancia.

Aunque es ampliamente aceptado que las enfermedades crónicas están vinculadas recíprocamente a los datos sobre el rendimiento, los mecanismos subyacentes aún no se han aclarado, lo que contribuye a las dificultades en el manejo de estas condiciones sistémicas morbosas y potencialmente mortales. Múltiples modelos animales experimentales, cada uno con ventajas y desventajas únicas, se han utilizado para estudiar la fisiopatología de PD^23,24. Centrándose específicamente en los modelos murinos, existen una variedad de protocolos a través de los cuales se facilita el estudio de los datos sobre el rendimiento; sin embargo, poseen varias deficiencias técnicas y fisiológicas^{25,26,27,28,29,30,31}.

En primer lugar, el modelo de ratón gavage oral requiere numerosas inoculaciones orales de patógenos periodontales humanos para generar inflamación gingival y pérdida ósea. Además, generalmente está precedido por un período de tratamiento antibiótico para subvertir la flora oral commensal^25. Este modelo a menudo requiere entrenamiento especializado para realizar con seguridad el gavage oral, utiliza sólo una pequeña fracción de patógenos periodontales del microbioma oral humano más complejo, y requiere varios meses para establecer la pérdida ósea alveolar.

Por el contrario, los modelos murinos inducidos químicamente utilizan la administración oral de ácido sulfónico de trinitrobenceno (TNBS) o sulfato de dextrano sódico (DSS), agentes comúnmente utilizados en el establecimiento de modelos murinos de colitis durante un período de varios meses para inducir la pérdida ósea periodontal²⁶. Están disponibles modelos intraorales y extraorales basados en abscesos, que involucran los incisivos murinos y tejidos del dorso, así como calvario, respectivamente. En el antiguo modelo de absceso, se administran varias inyecciones de bacterias, creando múltiples abscesos gingivales y una escasez de pérdida ósea alveolar, limitando su uso en el estudio de la DP. Los últimos modelos de absceso son significativamente más aptos para estudiar la virulencia bacteriana, la inflamación y la resorción ósea en sitios fuera de la cavidad oral, lo que elimina la evaluación del periodontium y el microbioma oral^{27,28,29,30,31}.

Utilizando el modelo de periodontitis inducido por la ligadura, comúnmente se ha instalado una sutura de seda trenzada circunferencialmente alrededor del segundo molar. Como alternativa, se puede insertar un único segmento lineal de material de sutura entre el primer y segundo molares^32,33. El objetivo de la colocación de la ligadura es facilitar la acumulación bacteriana y generar disbiosis dentro del sulci gingival, lo que resulta en inflamación del tejido periodontal y destrucción de los tejidos que componen el periodontium. Más notablemente, este modelo es capaz de producir significativamente más pérdida ósea alveolar en comparación con el más comúnmente utilizado gavage oral modelo³⁴. Complicando aún más el uso del modelo de gavage oral es la resistencia natural de varias cepas de ratones (es decir, C57BL/6) al desarrollo de la pérdida ósea alveolar. Esto también es problemático, ya que esta cepa es la más utilizada en la investigación animal basada en murinos^35.

Los procedimientos existentes descritos por Marchesan et al. y Abe y Hajishengallis fueron ideados para simplificar el acto técnico de colocación de la ligadura^33,36. Desafortunadamente, el antiguo protocolo requiere equipos especializados impresos en 3D y poseen el potencial de pérdida prematura de ligaduras, aumentando así el uso de animales y los costos asociados con el tiempo adicional invertido en el quirófano. Además, ambos protocolos generan sólo pequeñas regiones del periodontium enfermo disponiblepara un estudio.

Las ventajas que se centran en esta técnica se basan en el estudio simultáneo de la disbiosis oral y la inmunología que rigen el periodontium, la utilización de animales de bajo costo con diversos orígenes genéticos, y prácticas simples de vivienda y cría. Como tal, los objetivos deben ser maximizar los volúmenes de tejido enfermo y, en los intentos de practicar los principios de reducción de la investigación animal, reducir el consumo de animales a un nivel lo más bajo posible. Esto requiere garantizar que todos los animales puedan ser incluidos en los análisis experimentales³⁷. Sin embargo, cabe señalar que no importa qué modelo animal de enfermedad periodontal se utilice, no hay un solo modelo que abarque todos los elementos de la fisiopatología humana de la PD.

Este nuevo protocolo emplea la colocación de una ligadura alrededor de múltiples dientes molares maxilares utilizando instrumentación y materiales que se encuentran en la mayoría de los laboratorios. Permite una cantidad suficiente de tiempo para instalar fácil y seguramente una ligadura que es poco probable que se avule prematuramente. Por último, a medida que las PMN coordinan la destrucción del periodontio en la DP, también se presenta una metodología novedosa para recuperar neutrófilos orales de una manera análoga a los seres humanos.

Protocol

Todos los estudios murinos cumplieron con las regulaciones éticas pertinentes y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Toronto y la Junta de ética de investigación (Protocolo 20011930). 1. Instalación de ligaduras NOTA: Este es un procedimiento quirúrgico no estéril que se puede llevar a cabo en un quirófano estándar. El uso de animales libres de gérmenes (no cubiertos aquí) exige el manejo dentro de un gabinete de bioseg…

Representative Results

Se proporcionan datos representativos de citometría de flujo a partir de muestras de enjuague oral de una ingenua(Figura 3A)e inflamadas(Figura 3B)cavidad oral murina secundaria a la periodontitis inducida por ligaduras. También se demuestra la recuperación de las PMN de una ligadura instalada(Figura 3C). Las tensiones de canal del citómetro de flujo se calibraron manualmente, y…

Discussion

El elemento más crítico asociado con el uso del modelo de periodontitis inducido por la ligadura murina se centra en la retención de la ligadura hasta el momento del sacrificio o la eliminación intencional. La ligadura biopelícula-retentiva instalada es capaz de inducir una pérdida significativa de la altura ósea alveolar en tan solo 6 días, estancando entre el período de 11-16 días³⁹. La decisión de sacrificar a los sujetos animales antes del período máximo de pérdida ósea, lo que …

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL