Надежная Лигатура индуцированной модели Мурин пародонтит для оценки устных нейтрофилов

Summary

В этой статье представлен протокол для создания лигатуры индуцированной модели мурин пародонтита с участием нескольких челюстно-лицевой моляров, в результате чего большие области участвующих десен ткани и кости для последующего анализа, а также сокращение использования животных. Также описан метод оценки пероральных нейтрофилов по аналогии с человеческими субъектами.

Abstract

Основными преимуществами изучения патофизиологии пародонтального заболевания с использованием мочек морин являются снижение стоимости животных, массив генетически модифицированных штаммов, огромное количество анализов, которые можно проводить на собранных мягких и твердых тканях. Однако многие из этих систем подвергаются процедурной критике. В качестве альтернативы может быть использована модель пародонта, вызванная локализованным развитием и сохранением дисбиотического микробиома полости рта, которая быстро индуцирована и относительно надежна. К сожалению, варианты протокола пародонта, индуцированного лигатурой, изолированы в координационных регионах пародонта и подвержены преждевременному авруции установленной лигатуры. Это сводит к минимуму количество тканей, доступных для последующего анализа и увеличивает количество животных, необходимых для изучения. Этот протокол описывает точные манипуляции, необходимые для размещения расширенных моляровских лигатур с улучшенным удержанием и использованием новой техники смыва для восстановления пероральных нейтрофилов у мышей с альтернативным подходом, который смягчает вышеупомянутые технических проблем.

Introduction

Пародонта (PD) является остеолитикическое состояние, связанное со значительной заболеваемости хозяина и экономической нагрузки, которая проявляется воспаление десивов и потеря как мягких тканей и косой поддержки для пострадавших зубной протез^1,2,4. Этот процесс регулируется взаимодействиями между оральной микробиотой и врожденной иммунной системой хозяина. Это также связано с обострением других системных воспалительных заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания, и рак^5,6,7,8. Исторически сложилось так, было гипотеза, что PD патогенеза зависит от большого количества конкретных бактерий, таких как Porphyromonas gingivalis⁹. Тем не менее, последние данные свидетельствуют о том, что микробный компонент PD опосредовано стоматологической биопленки. Биопленка представляет собой организованное, сложное сообщество многочисленных микроорганизмов, которые могут существовать в здоровых симбиотических и разрушительных дисбиотических состояниях^10,11. Устные биопленки обычно обеспечивает устойчивость к хозяину, предотвращая создание очагов патогенных бактерий и способствует идеальной структуре и функции тканей десивной ткани путем регулирования иммунного ответа хозяина^12,13. Возмущения равновесных отношений между commensal организмов в полости рта и принимающей иммунной системы может привести к изменениям в ткани гомеостаза, в результате дисбактериоза и развития отличительной клинической и радиографической видимости PD^{5,10,12,13,14}.

Интересно, что создание устной дисбактериоз, хотя и требуется для начала PD, не является достаточным для привода PD во всех людей, ускользая от способности хозяина иммунный ответ, чтобы подорвать переход микробиоты между симбиотических и дисбиотических состояний¹⁵. Это ставит особое внимание на средства, с помощью которых PD влияет на одного из ведущих персонажей врожденной иммунной системы, а именно полиморфонуклеарные гранулоциты (PMN), или нейтрофилов, с местной и системной точки зрения^16,17.

У людей, PMNs набираются из циркуляции в размере 2 х 10⁶ клеток / ч в здоровых соединительных тканей пародонта, где они являются преобладающей популяции лейкоцитов. Здесь они впоследствии вытесняются из слизи gingival в полость рта в качестве компонента кревикулярной жидкости. При наличии PD, нейтрофилии проявляется в циркуляции и полости рта, где эти клетки-эффекторы обладают гипервоспалительным фенотипом, что приводит к вышеупомянутому разрушению пародонта^{17,18,19,20,21,22}. Поэтому понимание роли ПМН в ПД и других системных воспалительных заболеваниях имеет первостепенное значение.

Хотя широко признается, что хронические заболевания взаимно связаны с PD, основные механизмы еще предстоит выяснить, что усугубляет трудности в управлении этими болезненными и потенциально смертельными системными условиями. Несколько экспериментальных моделей животных, каждый с уникальными преимуществами и недостатками, были использованы для изучения патофизиологии PD^23,24. Сосредоточение особого внимания на моделях мурин, существуют различные протоколы, с помощью которых облегчается изучение PD; однако, они обладают несколькими техническими и физиологичными недостатками^{25,26,27,28,29,30,31}.

Во-первых, устные gavage мыши модель требует многочисленных устных прививок человеческих пародонтальных патогенов для создания воспаления десяна и потери костной массы. Кроме того, как правило, предшествует период лечения антибиотиками, чтобы подорвать минрин комменсальной оральной флоры²⁵. Эта модель часто требует специализированной подготовки, чтобы безопасно выполнять устные gavage, использует лишь небольшую часть пародонтальных патогенов из более сложных человеческих устных микробиома, и требует нескольких месяцев, чтобы установить альвеолярной потери костной массы.

В отличие от этого, химически индуцированных морин модели использовать устные доставки тринитробензена сульфоновой кислоты (TNBS) или декрен сульфат натрия (DSS), агенты обычно используются в создании мочеиспускательных моделей колита в течение нескольких месяцев, чтобы вызвать пародонтальной потери костной массы²⁶. Доступны внутриоральные и экстраоральные модели на основе абсцесса, которые включают в себя резцы и ткани мины на сум, а также кальварий, соответственно. В бывшей модели абсцесса, несколько инъекций бактерий вводят, создавая несколько деснных абсцессов и недостаток альвеолярной потери костной массы, ограничивая их использование в изучении PD. Последние абсцесс модели значительно более склонны к изучению бактериальной вирулентности, воспаления и резорбции костей на участках за пределами полости рта, что исключает оценку пародонта и орального микробиома^{27,28,29,30,31}.

Используя модель пародонтита, индуцированная лигатурой, плетеный шелковый шов обычно устанавливался по окружности вокруг второго моляра. В качестве альтернативы можно вставить один линейный сегмент шовного материала между первым и вторым молярами^32,33. Цель размещения лигатуры заключается в облегчении бактериального накопления и генерации дисбактериоза в сульчи десен, что приводит к воспалению пародонтальной ткани и разрушению тканей, составляющих пародонт. Наиболее примечательно, что эта модель способна производить значительно больше альвеолярной потери костной массы по сравнению с более часто используемым устным gavage модель³⁴. Еще более осложняет использование пероральной модели gavage является естественное сопротивление нескольких штаммов мышей (т.е., C57BL/6) к развитию альвеолярной потери костной массы. Это также проблематично, так как этот штамм является наиболее часто используемым в мурин основе исследований животных³⁵.

Существующие процедуры, описанные Marchesan et al. и Абэ и Гаджишенгаллис были разработаны для упрощения технического акта размещения лигатуры^33,36. К сожалению, прежний протокол требует специализированного 3D-печатного оборудования и обладает потенциалом для преждевременной потери лигатуры, тем самым увеличивая использование животных и затраты, связанные с дополнительным временем, затрачиваемым в операционной. Кроме того, оба протокола генерируют лишь небольшие области больного пародонтия, доступные для исследования.

Преимущества, которые лежат с этой техникой основываются в одновременном изучении перорального дисбактериоза и иммунологии, которые регулируют пародонтум, использование недорогих животных с разнообразным генетическим образованием, а также простое жилье и методы ведения земледелия. Таким образом, цели должны заключаться в максимизации объемов заболеваний тканей и, в попытках практиковать принципы сокращения исследований на животных, снизить потребление животных до максимально низкого уровня. Это требует обеспечения того, чтобы все животные могут быть включены в экспериментальные анализы^37. Однако следует отметить, что независимо от того, какая животное модель пародонта используется, нет единой модели, которая охватывает каждый элемент патологиологии PD человека.

Этот новый протокол использует размещение лигатуры вокруг нескольких челюстно-лицевых молочных зубов с использованием приборов и материалов, которые находятся в большинстве лабораторий. Это позволяет достаточное количество времени, чтобы легко и уверенно установить лигатуру, которая вряд ли avulse преждевременно. Наконец, по мере того, как ПМН координируют разрушение пародонта в PD, также представлена новая методология восстановления пероральных нейтрофилов, аналогичная людям.

Protocol

Все исследования по изучению морина соответствовали соответствующим этическим нормам и были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Торонто и Советом по этике исследований (Protocol 20011930). 1. Установка лигатуры ПРИМЕЧАНИЕ: Это нестерильная хирур…

Representative Results

Представитель потока цитометрии данные из устных промыть образцы наивной(Рисунок 3А) и воспаленной(Рисунок 3B) мурин полости рта вторичной лигатуры индуцированного пародонтита предоставляются. Также демонстрируется восстановление ПМ…

Discussion

Наиболее важный элемент, связанный с использованием мурин лигатуры индуцированной модели пародонтита сосредоточена вокруг удержания лигатуры до времени жертвоприношения или преднамеренного удаления. Установленная биопленка-ретентивная лигатура способна вывешить значительную пот…

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL