Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

Summary

Este artigo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo induzido por ligadura de periodontite murine envolvendo múltiplos molares maxilars, resultando em áreas maiores do tecido gingival envolvido e osso para análise posterior, bem como redução do uso animal. Uma técnica para avaliar neutrófilos orais de uma forma análoga aos seres humanos também é descrita.

Abstract

As principais vantagens do estudo da fisiopatologia da doença periodontal utilizando modelos de urina são o custo reduzido dos animais, a variedade de cepas geneticamente modificadas, o grande número de análises que podem ser realizadas em tecidos macios e duros colhidos. No entanto, muitos destes sistemas estão sujeitos a críticas processuais. Como alternativa, o modelo induzido pela ligadura da doença periodontal, impulsionado pelo desenvolvimento localizado e retenção de um microbioma oral disbiótico, pode ser empregado, o que é rapidamente induzido e relativamente confiável. Infelizmente, as variantes do protocolo de periodontite murine induzida por ligadura são isoladas para regiões focais do periodontium e sujeitas à avulsão prematura da ligadura instalada. Isso minimiza a quantidade de tecido disponível para análises subsequentes e aumenta o número de animais necessários para estudo. Este protocolo descreve as manipulações precisas necessárias para colocar ligaduras molar estendidas com melhor retenção e uso de uma nova técnica de lavagem para recuperar neutrófilos orais em camundongos com uma abordagem alternativa que atenua o referido desafios técnicos.

Introduction

A doença periodontal (DP) é uma condição osteolítica associada à morbidade hospedeira significativa e carga econômica, que se manifesta pela inflamação gingival e perda de apego de tecidos moles e suporte osseoso para a dentição afetada^1,2,3,4. Este processo é regido por interações entre a microbiota oral e o sistema imunológico inato do hospedeiro. Também está associada à exacerbação de outras doenças inflamatórias sistêmicas, incluindo diabetes, doenças cardiovasculares e câncer^5,6,7,8. Historicamente, foi a hipótese de que a patogênese pd é dependente de grandes quantidades de bactérias específicas, como Porphyromonas gingivalis⁹. No entanto, evidências recentes sugerem que o componente microbiano da DP é mediado pelo biofilme odontológico. O biofilme é uma comunidade organizada e complexa de inúmeros microrganismos que podem existir em estados disbióticos e disbióticos saudáveis^10,11. O biofilme oral normalmente oferece resistência ao hospedeiro, impedindo o estabelecimento de focos de bactérias patogênicas e promove a estrutura e função ideal do tecido gingival através da regulação da resposta imune do hospedeiro^12,13. Perturbações da relação equilibrious entre organismos comensal dentro da cavidade oral e do sistema imunológico hospedeiro podem levar a alterações na homeostase tecidual, resultando em disbacteriose e desenvolvimento das aparências clínicas e radiográficas de marca registrada de PD^{5,10,12,13,14}.

Curiosamente, o estabelecimento de uma disbacteriose oral, embora necessária para o início da DP, não é suficiente para conduzir a DP em todos os indivíduos, iludindo-se para a capacidade da resposta imune do hospedeiro para subverter a transição da microbiota entre os estados simbióticos e disbióticos¹⁵. Isso coloca um foco particular sobre os meios através dos quais a DP influencia um dos personagens principais do sistema imunológico inato, ou seja, o granulocito polimorfóide (PMN), ou neutrófilo, a partir de perspectivas locais e sistêmicas^16,17.

Em seres humanos, PMNs são recrutados a partir da circulação a uma taxa de ~ 2 x 10⁶ células / h em tecidos conectivos periodontais saudáveis, onde são a população de leukócitos predomáveis. Aqui, eles são posteriormente expulsos do sulco gingival na cavidade oral como um componente do líquido crevicular gingival. Na presença de DP, a neufilia se manifesta dentro da circulação e da cavidade oral, onde essas células efetoras possuem um fenótipo hiperinflamatório que leva à destruição acima mencionada do periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Portanto, entender o papel das PMNs na DP e em outras condições inflamatórias sistêmicas é de extrema importância.

Embora seja amplamente aceito que as doenças crônicas estejam reciprocamente ligadas à DP, os mecanismos subjacentes ainda não foram elucidados, contribuindo para dificuldades na gestão dessas condições sistêmicas mórbidas e potencialmente fatais. Vários modelos animais experimentais, cada um com vantagens e desvantagens únicas, têm sido utilizados para estudar a fisiopatologia da DP^23,24. Concentrando-se especificamente em modelos de urina, há uma variedade de protocolos através dos quais o estudo da DP é facilitado; no entanto, possuem várias deficiências técnicas e fisiométricas^{25,26,27,28,29,30,31}.

Primeiro, o modelo oral do rato do gavage exige inoculations orais numerosos de micróbios patogénicos periodontais humanos para gerar a inflamação do gingival e a perda do osso. Além disso, é geralmente precedido por um período de tratamento antibiótico para subverter a flora oral murine commensal²⁵. Este modelo muitas vezes requer treinamento especializado para realizar com segurança o gavage oral, usa apenas uma pequena fração de patógenos periodontais do microbioma oral humano mais complexo e requer vários meses para estabelecer a perda de ossos alveolares.

Em contraste, modelos de urina quimicamente induzida utilizam a entrega oral de ácido sulfonic trinitrobenzene (TNBS) ou sódio de sulfato dextran (DSS), agentes comumente usados no estabelecimento de modelos de colite murina durante um período de vários meses para induzir a perda de ossos periodontais²⁶. Modelos à base de abscesso intraoral e extraoral estão disponíveis, que envolvem os incisivos e tecidos de urina do dorsum, bem como calvarium, respectivamente. No antigo modelo abscesso, várias injeções de bactérias são administradas, criando múltiplos abcessos gingival e uma escassez de perda óssea alveolar, limitando seu uso no estudo da DP. Os últimos modelos de abscesso são significativamente mais aptos a estudar a virulência bacteriana, inflamação e resorção óssea em locais fora da cavidade oral, o que elimina a avaliação do periodontium e microbioma oral^{27,28,29,30,31}.

Usando o modelo de periodontite induzido por ligadura, uma sutura de seda trançada tem sido comumente instalada circunferentemente em torno do segundo molar. Como alternativa, um único segmento linear de material de sutura pode ser inserido entre o primeiro e o segundo molares^32,33. O objetivo da colocação da ligadura é facilitar o acúmulo bacteriano e gerar disbiose dentro dos sulci de gingival, resultando na inflamação do tecido periodontal e na destruição dos tecidos que compõem o periodontium. Mais notavelmente, este modelo é capaz de produzir significativamente mais perda óssea alveolar em comparação com o modelo de gavage oral³⁴mais comumente usado. Complicando ainda mais o uso do modelo de gavage oral é a resistência natural por várias cepas de camundongos (ou seja, C57BL/6) ao desenvolvimento de perda óssea alveolar. Isso também é problemático, pois esta cepa é a mais utilizada na pesquisa animal baseada em urina^35.

Os procedimentos existentes descritos por Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis foram concebidos para simplificar o ato técnico de colocar a ligadura^33,36. Infelizmente, o protocolo anterior requer equipamentos especializados impressos em 3D e possuem o potencial de perda de ligadura prematura, aumentando assim o uso de animais e os custos associados ao tempo adicional gasto na sala de cirurgia. Além disso, ambos os protocolos geram apenas pequenas regiões do periodontium doente disponíveis para um estudo.

As vantagens que se encontram com esta técnica baseiam-se no estudo simultâneo da disbiose oral e imunologia que regem o periodontium, utilização de animais de baixo custo com diversas origens genéticas e práticas simples de habitação e pecuária. Como tal, os objetivos devem ser maximizar os volumes de tecidos doentes e, na tentativa de praticar os princípios de redução da pesquisa animal, reduzir o consumo animal a um nível tão baixo quanto possível. Isso requer garantir que todos os animais sejam capazes de serem incluídos nas análises experimentais^37. No entanto, deve-se notar que não importa qual modelo animal de doença periodontal é utilizado, não há um único modelo que abrange todos os elementos da fisiopatologia da DP humana.

Este novo protocolo emprega a colocação de uma ligadura em torno de vários dentes molar maxiares usando instrumentação e materiais que são encontrados na maioria dos laboratórios. Permite uma quantidade de tempo suficiente instalar facilmente e confiàvelmente uma ligadura que seja pouco susceptível de avulse prematuramente. Finalmente, à medida que as PMNs coordenam a destruição do periodontium em PD, também é apresentada uma nova metodologia para recuperar neutrófilos orais de forma análoga aos seres humanos.

Protocol

Todos os estudos de urina cumpriram os regulamentos éticos relevantes e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Universidade de Toronto e pelo Research Ethics Board (Protocol 20011930). 1. Instalação da ligadura NOTA: Este é um procedimento cirúrgico não-estéril que pode ser realizado em uma sala de cirurgia padrão. O uso de animais livres de germes (não cobertos aqui) exige o manuseio dentro de um armário de biossegurança, o uso de instrume…

Representative Results

Dados representativos de citometria de fluxo de amostras de lavagem oral de uma ingênua(Figura 3A)e inflamado(Figura 3B) murine cavidade oral secundária à periodontite induzida pela ligadura são fornecidos. A recuperação de PMNs de uma ligadura instalada também é demonstrada(Figura 3C). As tensões do canal do cytometer do fluxo foram calibradas manualmente, e a compensaçã…

Discussion

O elemento mais crítico associado ao uso do modelo de periodontite induzido pela ligadura murine é centrado em torno da retenção da ligadura até o momento do sacrifício ou remoção intencional. A ligadura biofilme-retentive instalada é capaz de induzir uma perda significativa de altura alveolar do osso em tão poucos quanto 6 dias, platô entre o período de 11-16 dias³⁹. A decisão de sacrificar indivíduos animais antes do período máximo de perda óssea, tornando este um modelo muito m…

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL