Robust osufilazione modello di Murine Periodontitis per la valutazione dei neutrofili orali

Summary

Questo articolo presenta un protocollo per stabilire un modello di parodontite indotta da legatura di parodontite murina che coinvolge molari maxillari multipli, con conseguente aree più grandi del tessuto gengivale e dell’osso coinvolti per l’analisi successiva, nonché l’uso ridotto degli animali. Viene descritta anche una tecnica per valutare i neutrofili orali in modo analogo ai soggetti umani.

Abstract

I principali vantaggi dello studio della fisiopatologia della malattia parodontale utilizzando modelli murini sono la riduzione del costo degli animali, la gamma di ceppi geneticamente modificati, il gran numero di analisi che possono essere eseguite su tessuti molli e duri raccolti. Tuttavia, molti di questi sistemi sono oggetto di critiche procedurali. In alternativa, può essere impiegato il modello di malattia parodontale indotta dalla legatura, guidata dallo sviluppo localizzato e dalla ritenzione di un microbioma orale disbiotico, che è rapidamente indotto e relativamente affidabile. Purtroppo, le varianti del protocollo di parodontite murina indotta dalla legatura sono isolate nelle regioni focali del parodonto e soggette ad avulsione prematura della legatura installata. Questo riduce al minimo la quantità di tessuto disponibile per le analisi successive e aumenta il numero di animali necessari per lo studio. Questo protocollo descrive le manipolazioni precise necessarie per inserire legature molare estese con una migliore ritenzione e l’uso di una nuova tecnica di risciacquo per recuperare i neutrofili orali nei topi con un approccio alternativo che mitiga i suddetti sfide tecniche.

Introduction

La malattia parodontale (PD) è una condizione osteolitica associata a una significativa morbilità dell’ospite e onere economico, che si manifesta con infiammazione gengivale e perdita sia dell’attaccamento dei tessuti molli che del supporto osseo per la dentizione interessata^1,2,3,4. Questo processo è regolato dalle interazioni tra il microbiota orale e il sistema immunitario innato dell’ospite. È anche associato con esacerbazione di altre malattie infiammatorie sistemiche tra cui il diabete, malattie cardiovascolari, e il cancro^5,6,7^,8. Storicamente, è stato ipotizzato che la patogenesi della PD dipende da grandi quantità di batteri specifici come Porphyromonas gingivalis⁹. Tuttavia, prove recenti suggeriscono che la componente microbica della PD è mediata dal biofilm dentale. Il biofilm è una comunità organizzata e complessa di numerosi microrganismi che possono esistere in sani stati simbiotici e distruttivi disbiotici^10,11. Il biofilm orale normalmente offre resistenza all’ospite impedendo la creazione di foci di batteri patogeni e promuove la struttura e la funzione del tessuto gengivale ideale attraverso la regolazione della risposta immunitaria dell’ospite^12,13. Le perturbazioni della relazione equilibriosa tra gli organismi commensali all’interno della cavità orale e il sistema immunitario ospite possono portare ad alterazioni dell’omeostasi dei tessuti, con conseguente disbatteriosi e sviluppo del segno distintivo delle comparse cliniche e radiografiche di PD^{5,10,12,13,14}.

È interessante notare che la creazione di una disbatteriosi orale, sebbene necessaria per l’avvio della PD, non è sufficiente per guidare la PD in tutti gli individui, eludendo verso la capacità della risposta immunitaria dell’ospite di sovvertire la transizione del microbiota tra stati simbiotici e disbiotici¹⁵. Questo pone un particolare riflettore sui mezzi attraverso i quali la PD influenza uno dei principali caratteri del sistema immunitario innato, vale a dire il granulocito polimorfonucleare (PMN), o neutrofilo, da prospettive locali e sistemiche^16,17.

Nell’uomo, le PNN vengono reclutate dalla circolazione ad un tasso di 2 x 10⁶ cellule/h nei tessuti connettivi parodontali sani, dove sono la popolazione di leucociti predominante. Qui, vengono successivamente espulsi dal solco gengivale nella cavità orale come componente del liquido crevicolare gengivale. In presenza della PD, la neutrofilia si manifesta all’interno della circolazione e della cavità orale, dove queste cellule eftori possiedono un fenotipo iperinfiammatorio che porta alla suddetta distruzione del parontium^17,18,19,20^,21,22. Pertanto, comprendere il ruolo delle PMN nella PD e in altre condizioni infiammatorie sistemiche è della massima importanza.

Anche se è ampiamente riconosciuto che le malattie croniche sono reciprocamente legate alla PD, i meccanismi sottostanti devono ancora essere chiariti, contribuendo a difficoltà nella gestione di queste condizioni sistemiche morbose e potenzialmente fatali. Diversi modelli animali sperimentali, ciascuno con vantaggi e svantaggi unici, sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia del PD^23,24. Concentrandosi in particolare sui modelli murini, ci sono una varietà di protocolli attraverso i quali lo studio della PD è facilitato; tuttavia, essi possiedono diverse carenze tecniche e fisiologiche^{25,26,27,28,29,30,31}.

In primo luogo, il modello di topo gavage orale richiede numerose inoculazioni orali di patogeni parodontali umani per generare infiammazione gengivale e perdita ossea. Inoltre, è generalmente preceduto da un periodo di trattamento antibiotico per sovvertire la flora orale murina^{commensale 25}. Questo modello spesso richiede una formazione specializzata per eseguire in modo sicuro il gavage orale, utilizza solo una piccola frazione di patogeni parodontali dal più complesso microbioma orale umano e richiede diversi mesi per stabilire la perdita ossea alveolare.

Al contrario, i modelli murini indotti chimicamente utilizzano la consegna orale di acido solforico trinitrobenzene (TNBS) o sodio solfato dextran (DSS), agenti comunemente utilizzati nella creazione di modelli murini di colite per un periodo di diversi mesi per indurre la perdita ossea periodoontale²⁶. Sono disponibili modelli a base di ascesso intraorale ed extraorale, che coinvolgono rispettivamente gli incisivi murini e i tessuti del dorsum e il calvario. Nel modello precedente di ascesso, vengono somministrate diverse iniezioni di batteri, creando ascessi gingivali multipli e una carenza di perdita ossea alveolare, limitando il loro uso nello studio della PD. Questi ultimi modelli di ascesso sono significativamente più adatti allo studio della virulenza batterica, dell’infiammazione e del riassorbimento osseo in siti al di fuori della cavità orale, che elimina la valutazione del paroto e del microbioma orale^27,28,29^,30,31.

Utilizzando il modello indotto dalla legatura della parodontite, una sutura di seta intrecciata è stata comunemente installata ciferenzialmente intorno al secondo molare. In alternativa, è possibile inserire un singolo segmento lineare di materiale di sutura tra il primo e il secondo molari^32,33. L’obiettivo del posizionamento della legatura è quello di facilitare l’accumulo batterico e generare disbiosi all’interno del sulci gengivale, con conseguente infiammazione del tessuto parodontale e distruzione dei tessuti che compongono il parodonto. In particolare, questo modello è in grado di produrre significativamente più perdita ossea alveolare rispetto al modello di gavage orale più comunemente usato³⁴. A complicare ulteriormente l’uso del modello di gavage orale è la resistenza naturale da parte di diversi ceppi di topi (cioè C57BL/6) allo sviluppo della perdita ossea alveolare. Questo è anche problematico, in quanto questo ceppo è il più frequentemente utilizzato nella ricerca animale a base di murini³⁵.

Le procedure esistenti descritte da Marchesan et al. e Abe e Hajishengallis sono state ideate per semplificare l’atto tecnico di collocare la legatura^33,36. Purtroppo, il primo protocollo richiede attrezzature specializzate stampate in 3D e possiede il potenziale per la perdita prematura delle legature, aumentando così l’uso degli animali e i costi associati al tempo aggiuntivo trascorso in sala operatoria. Inoltre, entrambi i protocolli generano solo piccole regioni del parodonto malato disponibili per uno studio.

I vantaggi che si trovano con questa tecnica sono radicati nello studio simultaneo della disbiosi orale e dell’immunologia che governano il parodonto, l’utilizzo di animali a basso costo con diversi background genetici e semplici pratiche abitative e allevamento. Come tale, gli obiettivi dovrebbero essere di massimizzare i volumi di tessuto malato e, nel tentativo di praticare i principi di riduzione della ricerca animale, ridurre il consumo di animali a un livello il più basso possibile. Ciò richiede che tutti gli animali siano in grado di essere inclusi nelle analisi sperimentali³⁷. Tuttavia, va notato che non importa quale modello animale della malattia parodontale viene utilizzato, non esiste un singolo modello che comprenda ogni elemento della fisiopatologia della PD.

Questo nuovo protocollo impiega il posizionamento di una legatura intorno a più denti molari mascellare utilizzando strumentazione e materiali che si trovano all’interno della maggior parte dei laboratori. Permette una quantità sufficiente di tempo per installare facilmente e con sicurezza una legatura che è improbabile che si amvulsi prematuramente. Infine, poiché le PMN coordinano la distruzione del parodonto nella PD, viene presentata anche una nuova metodologia per recuperare i neutrofili orali in modo analogo agli esseri umani.

Protocol

Tutti gli studi murine rispettavano i pertinenti regolamenti etici e sono stati approvati dall’Università di Toronto Animal Care Committee e dal Research Ethics Board (Protocollo 20011930). 1. Installazione della legatura NOTA: Questa è una procedura chirurgica non sterile che può essere eseguita in una sala operatoria standard. L’uso di animali privi di germi (non qui trattato) impone la manipolazione all’interno di un armadio di biosicurezza, l’uso di strumenti s…

Representative Results

Vengono forniti dati relativi alla citometria di flusso rappresentativo proveniente da campioni di risciacquo orale di un’ingenua (Figura 3A) e infiammata (Figura 3B) di cavità orale che si trovano secondaria mente alla parodontite indotta dalla legatura. Viene inoltre illustrato il ripristino di PMN da una legatura installata (Figura 3C). Le tensioni del canale del citometro di fl…

Discussion

L’elemento più critico associato all’uso del modello di parodontite indotta dalla legatura murina è centrato intorno alla ritenzione della legatura fino al momento del sacrificio o della rimozione intenzionale. La legatura biofilm-retentiva installata è in grado di indurre una significativa perdita di altezza ossea alveolare in appena 6 giorni, plateauing tra il periodo di 11-16 giorni³⁹. La decisione di sacrificare i soggetti animali prima del periodo massimo di perdita ossea, rendendo questo …

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL