Robuste Ligatur-induzierte Modell der Murine Parodontitis für die Bewertung von oralen Neutrophilen
Summary
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Erstellung eines Ligatur-induzierten Modells der murinen Parodontitis mit mehreren Kiefer-Molaren, was zu größeren Bereichen des beteiligten Zahnfleischgewebes und Knochen für die nachfolgende Analyse sowie reduzierten Tiergebrauch. Eine Technik zur Beurteilung oraler Neutrophile in einer Weise, die dem menschlichen Probanden entspricht, wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
Die Hauptvorteile der Untersuchung der Pathophysiologie der Parodontitis unter Verwendung muriner Modelle sind die reduzierten Kosten von Tieren, eine Reihe genetisch veränderter Stämme, die große Anzahl von Analysen, die an geernteten weich und harten Geweben durchgeführt werden können. Viele dieser Systeme unterliegen jedoch Verfahrenskritik. Als Alternative kann das ligaturinduzierte Modell der Parodontitis eingesetzt werden, das durch die lokalisierte Entwicklung und Retention eines dysbiotischen oralen Mikrobioms angetrieben wird, das schnell induziert und relativ zuverlässig ist. Leider sind die Varianten des ligaturinduzierten murinen Parodontitisprotokolls zu fokalen Regionen des Parodontiums isoliert und unterliegen einer vorzeitigen Avulsion der installierten Ligatur. Dadurch wird die für nachfolgende Analysen verfügbare Gewebemenge minimiert und die Anzahl der für die Untersuchung erforderlichen Tiere erhöht. Dieses Protokoll beschreibt die präzisen Manipulationen, die erforderlich sind, um erweiterte Molligaturen mit verbesserter Retention und Verwendung einer neuartigen Spültechnik zur Wiederherstellung oraler Neutrophilen bei Mäusen mit einem alternativen Ansatz, der die oben genannten technischen Herausforderungen.
Introduction
Parodontitis (PD) ist eine osteolytische Erkrankung, die mit einer signifikanten Wirtsmorbidität und wirtschaftlichen Belastung verbunden ist, die sich durch Zahnfleischentzündung und Verlust der Weichteilanhaftung und der ossösen Unterstützung für das betroffene Gebiss1,2,3,4manifestiert. Dieser Prozess wird durch Wechselwirkungen zwischen der oralen Mikrobiota und dem angeborenen Immunsystem des Wirts bestimmt. Es ist auch verbunden mit Verschlimmerung von anderen systemischen entzündlichen Erkrankungen wie Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und Krebs5,6,7,8. Historisch wurde vermutet, dass pd Pathogenese von großen Mengen spezifischer Bakterien wie Porphyromonas gingivalis9abhängig ist. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass die mikrobielle Komponente von PD durch den zahnärztlichen Biofilm vermittelt wird. Der Biofilm ist eine organisierte, komplexe Gemeinschaft zahlreicher Mikroorganismen, die in gesunden symbiotischen und destruktiven dysbiotischen Zuständen existieren können10,11. Der orale Biofilm bietet normalerweise Resistenzen gegen den Wirt, indem er die Etablierung von Brennpunkten pathogener Bakterien verhindert und fördert die ideale Zahnfleischgewebestruktur und -funktion durch Regulierung der Wirtsimmunantwort12,13. Störungen der gleichgewichtikomischen Beziehung zwischen commensalen Organismen innerhalb der Mundhöhle und dem Wirtsimmunsystem können zu Veränderungen der Gewebehomöostase führen, was zu Dysbakteriose und Entwicklung des markenzeichen klinischen und radiographischen Aussehens von PD5,10,12,13,14führt.
Interessanterweise ist die Etablierung einer oralen Dysbakteriose, während für die Einleitung von PD erforderlich, nicht ausreichend, um PD bei allen Personen zu treiben, in Richtung der Fähigkeit des Wirts Immunantwort, den Übergang von Mikrobiota zwischen symbiotischen und dysbiotischen Zuständen zu untergraben15. Dies wirft ein besonderes Schlaglicht auf die Mittel, mit denen PD eine der Hauptfiguren des angeborenen Immunsystems beeinflusst, nämlich das polymorphonukleare Granulozyten (PMN), oder Neutrophil, aus lokaler und systemischer Perspektive16,17.
Beim Menschen werden PMNs mit einer Rate von 2 x 106 Zellen/h in gesunden parodontalen Bindegeweben aus dem Kreislauf rekrutiert, wo sie die vorherrschende Leukozytenpopulation sind. Hierbei werden sie anschließend als Bestandteil der Zahnfleischflüssigkeit aus dem Zahnfleischsulkus in die Mundhöhle ausgestoßen. In Gegenwart von PD manifestiert sich Neutrophie in der Zirkulation und Mundhöhle, wo diese Effektorzellen einen hyperinflammatorischen Phänotyp besitzen, der zur oben genannten Zerstörung des Parodontiums17,18,19,20,21,22führt. Daher ist es von größter Bedeutung, die Rolle von PMNs bei PD und anderen systemischen entzündungshemmenden Erkrankungen zu verstehen.
Obwohl weithin anerkannt ist, dass chronische Krankheiten wechselseitig mit PD in Verbindung gebracht werden, müssen die zugrunde liegenden Mechanismen noch aufgeklärt werden, was zu Schwierigkeiten bei der Bewältigung dieser morbiden und potenziell tödlichen systemischen Bedingungen beiträgt. Mehrere experimentelle Tiermodelle, jedes mit einzigartigen Vor- und Nachteilen, wurden verwendet, um die Pathophysiologie von PD23,24zu studieren. Mit Blick auf murine Modelle, gibt es eine Vielzahl von Protokollen, durch die die Untersuchung von PD erleichtert wird; sie besitzen jedoch mehrere technische und physiologische Mängel25,26,27,28,29,30,31.
Erstens erfordert das orale Gavage-Maus-Modell zahlreiche orale Impfungen menschlicher Parodontalerreger, um Zahnfleischentzündungen und Knochenverlust zu erzeugen. Zusätzlich, Es ist in der Regel von einer Periode der Antibiotika-Behandlung voran, um die murine commensale orale Flora zu unterwandern25. Dieses Modell erfordert oft eine spezielle Schulung, um die orale Gavage sicher durchzuführen, verwendet nur einen kleinen Bruchteil der parodontalen Krankheitserreger aus dem komplexeren menschlichen oralen Mikrobiom und erfordert mehrere Monate, um den Knochenverlust von Alveolar zu etablieren.
Im Gegensatz dazu nutzen chemisch induzierte murine Modelle die orale Abgabe von Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) oder Dextransulfat-Natrium (DSS), Wirkstoffe, die häufig bei der Etablierung von murinen Modellen der Kolitis über einen Zeitraum von mehreren Monaten verwendet werden, um parodontalen Knochenverlust zu induzieren26. Es stehen intraorale und extraorale Abszessmodelle zur Verfügung, die die murinen Schneidezähne und Gewebe des Dorsums bzw. Desvariums betreffen. Im früheren Abszessmodell werden mehrere Injektionen von Bakterien verabreicht, wodurch mehrere Gingivaabszesse und ein Mangel an Alveolarknochenverlust entstehen, was ihre Verwendung in der Studie von PD begrenzt. Letztere Abszessmodelle sind deutlich geeigneter, bakterielle Virulenz, Entzündungen und Knochenresorption an Stellen außerhalb der Mundhöhle zu untersuchen, was die Bewertung des Parodontiums und des oralen Mikrobioms27,28,29,30,31eliminiert.
Mit dem ligaturinduzierten Modell der Parodontitis wurde üblicherweise eine geflochtene Seidennaht um den zweiten Molaren herum installiert. Alternativ kann ein einzelnes lineares Segment von Nahtmaterial zwischen dem ersten und zweiten Molaren32,33eingefügt werden. Das Ziel der Ligatur Platzierung ist es, bakterielle Ansammlung zu erleichtern und Dysbiose innerhalb der Zahnfleischsulci zu erzeugen, was zu parodontalen Gewebeentzündungen und Zerstörung der Gewebe, die das Parodontium bilden. Vor allem ist dieses Modell in der Lage, deutlich mehr alveolären Knochenverlust im Vergleich zu den häufiger verwendeten oralen Gavage Modell34produzieren. Erschwerend kommt hinzu, dass die Natürliche Resistenz mehrerer Mäusestämme (d. h. C57BL/6) gegen die Entwicklung des Alveolarknochenverlustes durch mehrere Mäusestämme (d. h. C57BL/6) erschwert wird. Dies ist auch problematisch, da dieser Stamm am häufigsten in der murinenbasierten Tierforschung verwendet wird35.
Bestehende Verfahren, die von Marchesan et al. und Abe und Hajishengallis beschrieben wurden, wurden entwickelt, um den technischen Akt der Platzierung der Ligatur33,36zu vereinfachen. Leider erfordert das frühere Protokoll spezielle 3D-gedruckte Geräte und besitzt das Potenzial für vorzeitigen Ligaturverlust, wodurch der Einsatz von Tieren und die Kosten, die mit zusätzlicher Zeit im Operationssaal verbunden sind, erhöht werden. Darüber hinaus erzeugen beide Protokolle nur kleine Regionen des erkrankten Parodontiums, die für eine Studie zur Verfügung stehen.
Die Vorteile, die mit dieser Technik liegen, basieren auf der gleichzeitigen Untersuchung der oralen Dysbiose und Immunologie, die das Parodontium steuern, der Nutzung von Low-Cost-Tieren mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund und einfachen Haltungs- und Haltungspraktiken. Daher sollte das Ziel darin bestehen, das Volumen des erkrankten Gewebes zu maximieren und bei versuchen, die Grundsätze der Reduzierung der Tierforschung zu praktizieren, den Tierkonsum auf ein möglichst niedriges Niveau zu reduzieren. Dies erfordert, dass alle Tiere in die experimentellen Analysen einbezogen werden können37. Es sollte jedoch beachtet werden, dass unabhängig davon, welches Tiermodell der Parodontitis verwendet wird, es kein einziges Modell gibt, das jedes Element der menschlichen PD-Pathophysiologie umfasst.
Dieses neue Protokoll verwendet die Platzierung einer Ligatur um mehrere kieferlänstige Molzähne mit Instrumenten und Materialien, die in den meisten Laboratorien zu finden sind. Es lässt eine ausreichende Zeit, um einfach und sicher eine Ligatur zu installieren, die unwahrscheinlich ist, vorzeitig zu avulsieren. Schließlich wird, da PMNs die Zerstörung des Parodontiums in PD koordinieren, auch eine neuartige Methode zur Wiederherstellung oraler Neutrophile in einer weise vorgestellt, die dem Menschen ähnlich ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das kritischste Element, das mit der Verwendung des murinen Ligatur-induzierten Modells der Parodontitis verbunden ist, ist um die Beibehaltung der Ligatur bis zum Zeitpunkt des Opfers oder der absichtlichen Entfernung zentriert. Die installierte biofilmretentive Ligatur ist in der Lage, einen signifikanten Verlust der alveolären Knochenhöhe in nur 6 Tagen zu induzieren, Plateau zwischen dem 11-16 Tage Zeitraum39. Die Entscheidung, Tiersubjekte vor der maximalen Periode des Knochenverlustes zu o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. W. C. wird von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Chunxiang Sun für ihre Unterstützung bei der Durchführung der Trypan-Blaufärbung.
Materials
| Anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123131 | BV421, Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6G Antibody | BD | 560602 | PerCP-Cy5.5, Clone 1A8 |
| C57BL/6 Male Mice | Charles River | 8 to 12 weeks old | |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB15-500 | 15 mL |
| Conical Centrifuge Tube | FroggaBio | TB50-500 | 50 mL |
| FACS Buffer | Multiple | 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco) | |
| FACSDiva | BD | v8.0.1 | |
| Fibre-Lite | Dolan-Jenner | Model 180 | |
| FlowJo | Tree Star | v10.0.8r1 | |
| Heat Therapy Pump | Hallowell | HTP-1500 | |
| Hot Glass Bead Sterilizer | Electron Microscopy Sciences | 66118-10 | Germinator 500 |
| Iris Scissors | Almedic | 7602-A8-684 | Straight |
| Ketamine | Vetoquinol | 100mg/mL | |
| LSRFortessa | BD | X-20 | |
| Mouse Serum | Sigma | M5905-5ML | |
| Nylon Mesh Filter | Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 28908 | 16% (w/v), Methanol Free |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma | D1408-500ML | Without CaCl2 and MgCl2, 10x |
| Plastic Disposable Syringes | BD | 309659 | 1 mL |
| Rat Serum | Sigma | R9759-5ML | |
| Silk Suture | Covidien | SS652 | C13 USP 5-0 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7726-A10-700 | #1 |
| Splinter Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | #5 |
| Stereo Dissecting Microscope | Carl Zeiss | 28865 | Photo-Zusatz |
| Sterile Hypodemic Needle | BD | 305111 | 26G X 1/2" |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Xylazine | Rompun | 20mg/mL |
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