JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Oral Nötrofillerin Değerlendirilmesinde Mürin Periodontitin Sağlam Ligatür Kaynaklı Modeli

Published: January 21, 2020
doi:
10.3791/59667
,
1Department of Dental Oncology and Maxillofacial Prosthetics, Princess Margaret Cancer Centre,University Health Network, 2Faculty of Dentistry,University of Toronto

Summary

Bu makale, birden fazla maksiller molar içeren bir ligatür kaynaklı murine periodontitis modeli nin oluşturulması için bir protokol sunmaktadır, sonraki analizler için ilgili dişeti dokusu ve kemik daha geniş alanlarda sonuçlanan yanı sıra azaltılmış hayvan kullanımı. Oral nötrofilleri insan deneklere benzer bir şekilde değerlendirme tekniği de tanımlanmıştır.

Abstract

Murine modellerini kullanarak periodontal hastalığın patofizyolojisini incelemenin başlıca avantajları hayvanların düşük maliyeti, genetiği değiştirilmiş suşlar dizisi, hasat edilen yumuşak ve sert dokularda yapilebilen çok sayıda analizdir. Ancak, bu sistemlerin çoğu usule yönelik eleştirilere tabidir. Alternatif olarak, periodontal hastalığın ligatür kaynaklı modeli, lokalize gelişim ve bir disbiyotik oral mikrobiyom tutma tarafından tahrik, istihdam edilebilir, hangi hızla indüklenen ve nispeten güvenilir. Ne yazık ki ligatürkaynaklı murine periodontitis protokolünün varyantları periodontiumun odak bölgelerine izole edilmiştir ve kurulu ligaturun erken avulsiyonuna tabidir. Bu, sonraki analizler için kullanılabilir doku miktarını en aza indirir ve çalışma için gerekli hayvan sayısını artırır. Bu protokol, yukarıda bahsedilenleri azaltan alternatif bir yaklaşımla farelerde oral nötrofillerin kurtarılması için daha iyi tutma ve yeni bir durulama tekniği nin kullanımı ile uzun molar ligatürler yerleştirmek için gerekli kesin manipülasyonları açıklar teknik zorluklar.

Introduction

Periodontal hastalık (PH) önemli konak morbidite ve ekonomik yük ile ilişkili bir osteolitik durumdur, hangi dişeti iltihabı ve etkilenen dentition için hem yumuşak doku eki ve osseous destek kaybı ile kendini gösterir1,2,3,4. Bu süreç, oral mikrobiyota ve konak doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimler tarafından yönetilir. Ayrıca diyabet, kardiyovasküler hastalık ve kanser5,6,7,8dahil olmak üzere diğer sistemik inflamatuar hastalıkların alevlenme ile ilişkilidir. Tarihsel olarak, BU PD patogenezpors gibibelirli bakterilerin büyük miktarlarda bağımlı olduğu varsayımında 9. Ancak, son kanıtlar PH mikrobiyal bileşeni diş biyofilm aracılık olduğunu göstermektedir. Biyofilm sağlıklı simbiyotik ve yıkıcı disbiyotik devletlerde var olabilir çok sayıda mikroorganizmaların organize, karmaşık bir topluluktur10,11. Oral biyofilm normalde patojenik bakterilerin foci kurulmasını engelleyerek ev sahibine direnç sağlar ve konak bağışıklık yanıtı 12 düzenlenmesi ile ideal dişeti doku yapısı ve fonksiyonu teşvik12,13. Oral kavite içinde kommensal organizmalar ve konak bağışıklık sistemi arasındaki dengesel ilişkinin perturbations doku homeostaz değişikliklere yol açabilir, dysbacteriosis ve PD damgasını klinik ve radyografik görünümlerin gelişimi ile sonuçlanan5,10,12,13,14.

İlginçtir, oral disbacteriosis kurulması, PD başlatılması için gerekli iken, tüm bireylerde PH sürücü için yeterli değildir, simbiyotik ve disbiyotik durumlar arasında mikrobiyota geçiş bozmak için konak bağışıklık yanıtı yeteneğine doğru kaçan15. Bu pd doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önde gelen karakterlerinden biri, yani polimorfonükleer granülosit (PMN) veya nötrofil, yerel ve sistemik bakış açılarından16,17etkiler anlamına belirli bir spot yerleştirir .

İnsanlarda, PMN’ler sağlıklı periodontal bağ dokularında ~2 x 106 hücre/h oranında dolaşımdan alınırlar, burada hakim lökosit popülasyonudur. Burada, daha sonra dişeti kreviküler sıvı bir bileşeni olarak ağız boşluğuna dişeti sulkus atılır. PH varlığında, nötrofili dolaşım ve ağız boşluğu içinde tezahür, Bu efektör hücreleri periodontium yukarıda belirtilen imha yol açan bir hiperinflamatuar fenotip sahipnerede 17,18,19,20,21,22. Bu nedenle, PD ve diğer sistemik inflamatuar durumlarda PMN’lerin rolünü anlamak son derece önemlidir.

Kronik hastalıkların PH’ye karşılıklı olarak bağlı olduğu yaygın olarak kabul edilse de, altta yatan mekanizmalar henüz açıklığa kavuşturulamamıştır ve bu morbid ve potansiyel olarak ölümcül sistemik durumların yönetiminde zorluklara katkıda bulunmaktadır. Birden fazla deneysel hayvan modelleri, her biri benzersiz avantajları ve dezavantajları ile, PD23,24patofizyolojisi çalışmak için kullanılmıştır. Özellikle murine modellerine odaklanan pd çalışmasının kolaylaştırıldığı çeşitli protokoller vardır; ancak, çeşitli teknik ve fizyolojik eksiklikleri sahip25,26,27,28,29,30,31.

İlk olarak, oral gavage fare modeli dişeti iltihabı ve kemik kaybı oluşturmak için insan periodontal patojenlerin çok sayıda oral aşılama gerektirir. Ayrıca, genellikle antibiyotik tedavisi bir süre önce murine commensal oral flora yıkmak için25. Bu model genellikle güvenli bir şekilde oral gavaj gerçekleştirmek için özel eğitim gerektirir, daha karmaşık insan oral mikrobiyom periodontal patojenlerin sadece küçük bir kısmını kullanır, ve alveoler kemik kaybı kurmak için birkaç ay gerektirir.

Buna karşılık, kimyasal olarak indüklenen mürin modelleri trinitrobenzen sülfonik asit oral teslim kullanmak (TNBS) veya dekstran sülfat sodyum (DSS), ajanlar genellikle periodontal kemik kaybı neden birkaç aylık bir süre içinde kolit murine modelleri kurulmasında kullanılan26. Dorsumun mürin ifilsorve dokularının yanı sıra kalvaryum içeren intraoral ve ekstraoral apse bazlı modeller mevcuttur. Eski apse modelinde, bakteri çeşitli enjeksiyonlar uygulanır, birden fazla dişeti apse ve alveoler kemik kaybı eksikliği oluşturarak, PH çalışmada kullanımını sınırlayan. İkinci apse modelleri önemli ölçüde daha bakteriyel virülans çalışmaya apt, inflamasyon, ve ağız boşluğu dışında sitelerde kemik rezorpsiyonu, periodontium ve oral mikrobiyom değerlendirme ortadan kaldırır27,28,29,30,31.

Periodontitin ligatür kaynaklı modeli kullanılarak, örgülü ipek dikiş genellikle ikinci azı dişleri etrafında çevresel olarak yüklenmiştir. Alternatif olarak, dikiş malzemesinin tek bir doğrusal segmenti birinci ve ikinci azı dişleri arasına eklenebilir32,33. Ligatür yerleşiminin amacı bakteri birikimini kolaylaştırmak ve dişeti sülfür içinde disbiyoz oluşturmak, periodontal doku iltihabı ve periodontium oluşturan dokuların imha ile sonuçlanan. En önemlisi, Bu model daha yaygın olarak kullanılan oral gavage modeli34ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha alveoler kemik kaybı üretme yeteneğine sahiptir. Oral gavaj modelinin kullanımını daha da zorlaştıran şey, farelerin çeşitli suşlarının (c57BL/6) alveoler kemik kaybına karşı doğal direncidir. Bu aynı zamanda sorunludur, çünkü bu tür en sık kullanılan rürin bazlı hayvanaraştırmalarında 35′tir.

Marchesan ve ark. ve Abe ve Hajishengallis tarafından açıklanan mevcut prosedürler ligature33,36yerleştirerek teknik hareket basitleştirmek için icat edilebildi. Ne yazık ki, eski protokol özel 3D baskılı ekipman gerektirir ve erken ligatür kaybı potansiyeline sahip, bu nedenle artan hayvan kullanımı ve ameliyathanede harcanan ek zaman ile ilgili maliyetler. Ayrıca, her iki protokol de bir çalışma için mevcut hastalıklı periodontium sadece küçük bölgeler oluşturur.

Bu teknikle yatan avantajlar, periodontium’u yöneten oral disbiyoz ve immünolojinin eşzamanlı çalışmasında, farklı genetik geçmişe sahip düşük maliyetli hayvanların kullanımı ve basit barınma ve hayvancılık uygulamalarında temellenmiştir. Bu nedenle, hedefler hastalıklı doku hacimlerini en üst düzeye çıkarmak ve hayvan araştırmalarında azaltma ilkelerini uygulama girişimlerinde, hayvan tüketimini mümkün olduğunca düşük bir seviyeye düşürmek olmalıdır. Bu, tüm hayvanların deneysel analizlere dahil edilme lerini sağlamayı gerektirir37. Ancak, periodontal hastalığın hangi hayvan modeli kullanılırsa kullanılsın, insan PH patofizyolojisinin her unsurunu kapsayan tek bir model olmadığı unutulmamalıdır.

Bu yeni protokol, çoğu laboratuvarda bulunan enstrümantasyon ve malzemeler kullanılarak birden fazla maksiller azı dişinin etrafına bir bağ yerleştirilmelerini sağlar. Kolayca ve güvenle erken avulse olası olmayan bir ligatür yüklemek için yeterli miktarda zaman sağlar. Son olarak, PMN’ler PD’deki periodontium’un yok oluşunun koordinasyonu yla, oral nötrofilleri insanlara benzer bir şekilde kurtarmak için yeni bir metodoloji de sunulmuştur.

Protocol

Tüm murine çalışmaları ilgili etik düzenlemelere uygun ve Toronto Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi ve Araştırma Etik Kurulu (Protokol 2001930) tarafından onaylanmıştır. 1. Ligatür kurulumu NOT: Bu standart bir ameliyathanede yapIlebilen steril olmayan bir cerrahi işlemdir. Mikropsuz hayvanların kullanımı (burada kapsanmayan) bir biyogüvenlik kabini içinde işleme, steril aletlerin kullanımı ve periodontal patojenler ile oral kavitenin aşılan…

Representative Results

Oral durulama örneklerinden(Şekil 3A)ve iltihaplı (Şekil 3B) bağ kaynaklı periodontite sekonder olan murine oral kaviteden temsili akış sitometri verileri sağlanır. PmN’lerin yüklü bir ligatürden geri kazanımı da gösterilmiştir (Şekil 3C). Akış sitometre kanal gerilimleri manuel olarak kalibre edildi ve tek lekeli kompanzasyon boncukları ile telafi yapıldı. PM…

Discussion

Periodontitin murin ligatür kaynaklı modelinin kullanımı ile ilişkili en kritik unsur, kurban veya kasıtlı olarak çıkarılma zamanına kadar bağın tutulması etrafında ortalanır. Yüklü biyofilm-retentive ligatür az 6 gün içinde alveoler kemik yüksekliği önemli bir kayıp indükleyen yeteneğine sahiptir, 11-16 günlük dönem arasında platolama39. Kemik kaybının en üst düzey döneminden önce hayvan denekleri kurban etme kararı, bunu ligatür kaynaklı periodontitin çok…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J. W. C. Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) tarafından desteklenir. Yazarlar trypan mavi boyama performans onu yardım için Dr Chunxiang Sun teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -. P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Tags

Keywords: Ligature-inducedMurine PeriodontitisOral NeutrophilsMicrosurgical InstrumentsSurgical MicroscopeBraided Silk SutureMaxillary MolarsGingival SulcusSurgeon’s Knot
check_url/fr/59667?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image