Robust ligatur-induceret model af murine periodontitis til evaluering af orale neutrofiler

Summary

Denne artikel præsenterer en protokol til etablering af en ligatur-induceret model af murine parodontitis involverer flere maxillær molars, hvilket resulterer i større områder af de involverede gingival væv og knogler til efterfølgende analyse samt reduceret dyre brug. En teknik til at vurdere orale neutrofiler på en måde, der svarer til forsøgspersoner, er også beskrevet.

Abstract

De vigtigste fordele ved at studere Patofysiologi af Periodontal sygdom udnytter murine modeller er de reducerede udgifter til dyr, vifte af genetisk modificerede stammer, det store antal analyser, der kan udføres på høstede bløde og hårde væv. Mange af disse systemer er imidlertid genstand for en proceduremæssig kritik. Alternativt kan den ligatur-inducerede model for Periodontal sygdom, der drives af lokal udvikling og fastholdelse af et dysbiotisk oralt mikrobiom, anvendes, hvilket hurtigt induceres og er relativt pålideligt. Desværre, varianterne af ligatur-induceret murine parodontitis protokol er isoleret til fokale regioner af periodontium og underlagt for tidlig avulsionsfrakturer af den installerede ligatur. Dette minimerer mængden af væv til rådighed for efterfølgende analyser og øger antallet af dyr, der kræves for undersøgelse. Denne protokol beskriver de præcise manipulationer, der kræves for at placere udvidede molære ligaturer med forbedret fastholdelse og brug af en ny skylle teknik til at inddrive orale neutrofiler i mus med en alternativ tilgang, der mindsker ovennævnte tekniske udfordringer.

Introduction

Periodontal disease (PD) er en osteolytisk tilstand forbundet med signifikant vært sygelighed og økonomiske byrde, som er manifesteret ved gingival betændelse og tab af både blødt væv vedhæftet fil og ossøse støtte til den berørte tandsæt^1,2,3,4. Denne proces styres af interaktioner mellem den orale mikrobiota og det medfødte immunsystem af værten. Det er også forbundet med forværring af andre systemiske inflammatoriske sygdomme, herunder diabetes, hjerte-kar-sygdom, og kræft^5,6,7,8. Historisk set var det en hypotese, at PD patogenesen er afhængig af store mængder af specifikke bakterier såsom Porphyromonas gingivalis⁹. Nylige beviser tyder imidlertid på, at den mikrobielle bestanddel af PD er medieret af Dental biofilm. Biofilm er et organiseret, komplekst fællesskab af talrige mikroorganismer, der kan eksistere i sunde symbiotiske og destruktive dysbiotiske tilstande^10,11. Den orale biofilm giver normalt resistens over for værten ved at forhindre etablering af Foci af patogene bakterier og fremmer ideelle gingival væv struktur og funktion gennem regulering af værten immunrespons^12,13. Perturbationer af det ækvibriske forhold mellem kommensal organismer i mundhulen og værts immunsystemet kan føre til ændringer i vævs homøostase, hvilket resulterer i dysbacteriosis og udvikling af kendetegnende kliniske og radiografiske optrædener af PD^{5,10,12,13,14}.

Interessant, etablering af en mundtlig dysbacteriosis, mens det er nødvendigt for initiering af PD, er ikke tilstrækkelig til at drive PD i alle individer, glemt mod evnen af værten immunrespons til at undergrave overgangen af mikrobiota mellem symbiotiske og dysbiotiske stater¹⁵. Dette placerer et særligt fokus på de midler, hvorigennem PD påvirker en af de førende tegn i det medfødte immunsystem, nemlig polymorphonukleen granulocyt (PMN), eller neutrofile, fra lokale og systemiske perspektiver^16,17.

Hos mennesker rekrutteres Pmn’er fra cirkulationen med en hastighed på ~ 2 x 10⁶ celler/h i sunde parodontal bindevæv, hvor de er den dominerende leukocyt population. Her er de efterfølgende bortvist fra gingival sulcus i mundhulen som en bestanddel af gingival crevicular væske. I nærværelse af PD, neutrofili manifesterer inden for cirkulation og mundhulen, hvor disse Effector celler besidder en hyperinflammatorisk fænotype, der fører til ovennævnte ødelæggelse af periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Derfor er forståelse af PMNs rolle i PD og andre systemiske inflammatoriske tilstande af yderste vigtighed.

Selv om det er almindeligt anerkendt, at kroniske sygdomme er gensidigt forbundet med PD, er de underliggende mekanismer endnu ikke belyst, hvilket bidrager til vanskeligheder med håndteringen af disse morbid og potentielt dødelige systemiske tilstande. Flere eksperimentelle dyremodeller, hver med unikke fordele og ulemper, er blevet udnyttet til at studere Patofysiologi af PD^23,24. Fokus specifikt på murine modeller, der er en række protokoller, hvorigennem undersøgelsen af PD lettes; men de besidder flere tekniske og fysiologiske mangler^{25,26,27,28,29,30,31}.

Første, den orale sonde musemodel kræver talrige orale vaccinationer af humane Periodontal patogener til at generere gingival inflammation og knogletab. Derudover, det er generelt forud for en periode med antibiotisk behandling til at undergrave murine kommensal oral flora²⁵. Denne model kræver ofte specialiseret træning til sikkert at udføre den orale sonde, bruger kun en lille brøkdel af Periodontal patogener fra det mere komplekse humane orale mikrobiom, og kræver flere måneder til at etablere alveolært knogletab.

I modsætning hertil anvender kemisk inducerede murine modeller oral levering af trinitrobenzen sulfonsyre (TNB’ER) eller dextran sulfat natrium (DSS), agenter, der almindeligvis anvendes til at etablere murine-modeller af colitis over en periode på flere måneder for at inducere Periodontal knogletab²⁶. Intraorale og ekstra abscess-baserede modeller er tilgængelige, som involverer murine-incisorer og væv i dorsum samt calvarium, hhv. I den tidligere byld model, flere injektioner af bakterier administreres, skabe flere gingival abscesser og en mangel på alveolær knogletab, begrænse deres anvendelse i studiet af PD. Sidstnævnte byld modeller er betydeligt mere tilbøjelige til at studere bakteriel virulens, inflammation, og knogleresorption på steder uden for mundhulen, som eliminerer evaluering af periodontium og orale mikrobiom^{27,28,29,30,31}.

Ved hjælp af ligatur-induceret model af periodontitis, en flettet silke sutur er almindeligt blevet installeret omformet omkring den anden Molar. Alternativt kan der indsættes et enkelt lineært segment af suturmateriale mellem første og anden molarer^32,33. Målet med ligatur placeringen er at lette bakterie ophobning og generere dysbiosis i gingival sulci, resulterer i Periodontal væv betændelse og ødelæggelse af væv komponere periodontium. Mest bemærkelsesværdigt, denne model er i stand til at producere betydeligt mere alveolært knogletab i forhold til de mere almindeligt anvendte oral sonde model³⁴. Yderligere komplicere brugen af oral sonde model er den naturlige modstand af flere stammer af mus (dvs., C57BL/6) til at udvikle alveolær knogletab. Dette er også problematisk, da denne stamme er den hyppigst anvendte i murine-baseret dyreforskning³⁵.

De eksisterende procedurer beskrevet af marchesan et al. og abe og hajishengallis blev udtænkt for at forenkle den tekniske handling med at placere ligatur^33,36. Desværre kræver den tidligere protokol specialiseret 3D-printet udstyr og besidder potentialet for for tidligt ligatur tab, hvilket øger dyrenes brug og omkostningerne forbundet med ekstra tid tilbragt i operationsstuen. Desuden genererer begge protokoller kun små områder af det syge periodontium, der er til rådighed til en undersøgelse.

De fordele, der ligger med denne teknik er jordet i den samtidige undersøgelse af oral dysbiosis og Immunologi, der regulerer periodontium, udnyttelse af lavpris dyr med forskellige genetiske baggrunde, og enkle boliger og opdrætspraksis. Som sådan bør målene være at maksimere mængden af sygt væv og, i forsøget på at praktisere principperne for reduktion af dyreforsøg, reducere dyre forbruget til et niveau så lavt som muligt. Dette kræver, at alle dyr kan indgå i eksperimentelle analyser³⁷. Men, det skal bemærkes, at uanset hvilken dyremodel af Periodontal sygdom udnyttes, der er ingen enkelt model, der omfatter alle elementer af menneskelig PD patofysiologi.

Denne nye protokol beskæftiger placeringen af en ligatur omkring flere maxillær Molar tænder ved hjælp af instrumentering og materialer, der findes inden for de fleste laboratorier. Det giver en tilstrækkelig mængde tid til nemt og trygt at installere en ligatur, der er usandsynligt at avulse for tidligt. Endelig, som PMNs koordinere ødelæggelse af periodontium i PD, en ny metode til at inddrive orale neutrofiler på en måde svarende til mennesker er også præsenteret.

Protocol

Alle murine undersøgelser overholdt de relevante etiske regler og blev godkendt af University of Toronto Animal Care udvalg og Forskningsetiske Råd (protokol 20011930). 1. montering af ligatur Bemærk: Dette er en ikke-steril kirurgisk procedure, der kan udføres i en standard Operations Theater. Brugen af kimfri dyr (ikke dækket her) mandater håndtering i en biosikkerhed kabinet, brug af sterile instrumenter, og inokulering af mundhulen med Periodontal patogener …

Representative Results

Repræsentative flow cytometri data fra orale skylle prøver af en naiv (figur 3a) og betændset (figur 3B) murine mundhulen sekundær til ligatur-induceret parodontitis er tilvejebragt. Der påvises også genoprettelse af Pmn’er fra en installeret ligatur (figur 3C). Flow flowcytometer kanal spændinger blev kalibreret manuelt, og kompensation blev udført med enkelt plettet kompen…

Discussion

Det mest kritiske element i forbindelse med brugen af murine ligatur-induceret model af parodontitis er centreret omkring fastholdelse af ligatur indtil tidspunktet for offer eller forsætlig fjernelse. Den installerede biofilm-retentive ligatur er i stand til at inducere et betydeligt tab af alveolær knogle højde i så få som 6 dage, plateauing mellem den 11 – 16 dages periode³⁹. Beslutningen om at ofre dyremotiver før den maksimale periode af knogletab, hvilket gør dette til en meget kort…

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL