Robust Ligature-inducerad modell av murina parodontit för utvärdering av orala neutrofiler

Summary

Denna artikel presenterar ett protokoll för upprättande av en Ligature-inducerad modell av murina parodontit med flera maxillary molarer, vilket resulterar i större områden av de inblandade gingival vävnad och ben för efterföljande analys samt minskad användning av djur. En teknik för att bedöma orala neutrofiler på ett sätt som motsvarar de mänskliga försökspersonerna beskrivs också.

Abstract

De främsta fördelarna med att studera patofysiologin för parodontit använda murina modeller är den minskade kostnaden för djur, en rad genetiskt modifierade stammar, det stora antalet analyser som kan utföras på skördade mjuk och hård vävnad. Många av dessa system är dock föremål för procedurmässig kritik. Som ett alternativ, den ligatur-inducerad modell av parodontit, driven av lokaliserad utveckling och retention av en dysbiotic oral microbiome, kan användas, som snabbt induceras och relativt tillförlitlig. Tyvärr, de varianter av ligatur-inducerad murin parodontit protokollet är isolerade till fokala regioner i den och föremål för förtida avulsion av den installerade ligatur. Detta minimerar mängden vävnad som finns tillgänglig för efterföljande analyser och ökar antalet djur som krävs för studier. Detta protokoll beskriver de exakta manipulationer som krävs för att placera förlängda molar-ligaturer med förbättrad retention och användning av en ny sköljteknik för att återvinna orala neutrofiler hos möss med ett alternativt tillvägagångssätt som lindrar de tidigare nämnda tekniska utmaningar.

Introduction

Parodontit (PD) är ett osteolytiskt tillstånd i samband med betydande värd morbiditet och ekonomisk börda, vilket manifesteras av gingival inflammation och förlust av både mjuk vävnad kvarstad och bendefekter stöd för den drabbade tandbildning^1,2,3,4. Denna process styrs av interaktioner mellan den orala bakterieflora och medfödda immunförsvaret hos värden. Det är också förknippat med exacerbation av andra systemiska inflammatoriska sjukdomar inklusive diabetes, hjärt-kärlsjukdom, och cancer^5,6,7,8. Historiskt, det var en hypotes om att PD patogenes är beroende av stora mängder av specifika bakterier såsom Porphyromonas gingivalis⁹. De senaste bevisen tyder dock på att den mikrobiella komponenten i PD förmedlas av den odontologiska biofilmen. Den biofilm är en organiserad, komplex gemenskap av många mikroorganismer som kan existera i friska symbiotiska och destruktiva dysbiotiska stater^10,11. Den muntliga biofilm ger normalt motstånd mot värden genom att förhindra inrättandet av Foci av patogena bakterier och främjar ideal gingival vävnad struktur och funktion genom reglering av värden immunsvar^12,13. Perturbations av det equilibrious förhållandet mellan kommensaler organismer inom munhålan och värd immunsystemet kan leda till förändringar i vävnad homeostas, vilket resulterar i dysbacteriosis och utveckling av Hallmark kliniska och radiografiska framträdanden av PD^{5,10,12,13,14}.

Intressant, inrättandet av en muntlig dysbacteriosis, samtidigt som krävs för initiering av PD, är inte tillräckligt för att köra PD i alla individer, undkommer mot förmågan hos värden immunsvar att undergräva övergången av bakterieflora mellan symbiotiska och dysbiotiska stater¹⁵. Detta sätter en särskild strålkastarljuset på de medel genom vilka PD påverkar en av de ledande tecknen i det medfödda immunförsvaret, nämligen polymorfonukleära granulocyt (PMN), eller neutrofila, från lokala och systemiska perspektiv^16,17.

Hos människa rekryteras PMNs från cirkulationen med en hastighet av ~ 2 x 10⁶ celler/h i friska parodontala bindväv, där de är den dominerande leukocytpopulationen. Här, de är sedan utvisas från gingival sulcus i munhålan som en del av gingival crevicular vätska. I närvaro av PD, neutrofili manifesterar i cirkulationen och munhålan, där dessa effektorceller har en hyperinflammatorisk fenotyp som leder till den ovan nämnda förstörelsen av den^{17,18,19,20,21,22}. Därför är det ytterst viktigt att förstå PMNs roll i PD och andra systemiska inflammatoriska tillstånd.

Även om det är allmänt accepterat att kroniska sjukdomar är ömsesidigt knutna till PD, har de bakomliggande mekanismerna ännu inte klarlagts, vilket bidrar till svårigheterna i hanteringen av dessa sjukliga och potentiellt dödliga systemiska tillstånd. Flera experimentella djurmodeller, var och en med unika fördelar och nackdelar, har utnyttjats för att studera patofysiologin hos PD^23,24. Med särskilt fokus på murina modeller, det finns en mängd olika protokoll genom vilka studien av PD underlättas; de har dock flera tekniska och fysiologiska brister^{25,26,27,28,29,30,31}.

Först, den muntliga sonden musmodellen kräver många muntliga vaccinationer av mänskliga parodontala patogener att generera gingival inflammation och benförlust. Dessutom är det i allmänhet föregås av en period av antibiotikabehandling för att undergräva murina kommensaler oral Flora²⁵. Denna modell kräver ofta specialiserad utbildning för att säkert utföra den muntliga sonden, använder endast en liten del av parodontala patogener från mer komplexa mänskliga oral microbiome, och kräver flera månader för att etablera alveolära benförlust.

I motsats, kemiskt inducerade murin modeller utnyttja den muntliga leveransen av Trinitrobensen sulfonsyra (TNBS) eller dextran sulfate natrium (DSS), agenter som vanligen används för att fastställa murina modeller av kolit under en period av flera månader för att inducera parodontala benförlust²⁶. Intraorala och extraorala abscess-baserade modeller finns tillgängliga, som involverar murina incisorer och vävnader av dorsum samt calvarium, respektive. I fd abscess modell, flera injektioner av bakterier administreras, skapa flera gingival bölder och en brist på alveolära benförlust, begränsa deras användning i studien av PD. De senare abscess modellerna är betydligt mer benägna att studera bakteriell virulens, inflammation, och benresorption på platser utanför munhålan, vilket eliminerar utvärderingen av den och oral mikrobiomet^{27,28,29,30,31}.

Med hjälp av Ligature-inducerad modell av parodontit, en flätad sidensutur har vanligen installerats runt om den andra molar. Som ett alternativ kan ett enda linjärt segment av suturmaterial sättas in mellan den första och andra molarer^32,33. Målet med ligatur placeringen är att underlätta bakteriell ackumulering och generera dysbios inom gingival sulci, vilket resulterar i parodontala vävnad inflammation och förstörelse av vävnaderna komponera periodontium. Framför allt, denna modell är kapabel att producera betydligt mer alveolär benförlust jämfört med de vanligare orala sontmjöl modell³⁴. Ytterligare komplierar användningen av den muntliga sondmatning modellen är det naturliga motståndet av flera stammar av möss (dvs, C57BL/6) att utveckla alveolära benförlust. Detta är också problematiskt, eftersom denna stam är den mest använda i Murine-baserade djur forskning³⁵.

Befintliga förfaranden som beskrivs av marchesan et al. och Abe och hajishengallis utformades för att förenkla den tekniska handlingen att placera ligatur^33,36. Tyvärr kräver det tidigare protokollet specialiserad 3D-tryckt utrustning och besitter potentialen för för tidig ligatur förlust, vilket ökar djurens användning och kostnaderna i samband med ytterligare tid i operationssalen. Dessutom genererar båda protokollen endast små regioner av det sjuka den som finns för en studie.

De fördelar som ligger i denna teknik är förankrade i den samtidiga studien av oral dysbios och immunologi som styr periodontium, utnyttjande av låg kostnad djur med olika genetiska bakgrunder, och enkla bostäder och djurhållning praxis. Som sådana bör mål vara att maximera volymerna av sjuk vävnad och, i försök att öva principerna för minskning av djurförsök, minska djur konsumtionen till en så låg nivå som möjligt. Detta förutsätter att alla djur kan inkluderas i experimentella analyser³⁷. Det bör dock noteras att oavsett vilken djurmodell av parodontit utnyttjas, det finns ingen enda modell som omfattar varje del av mänskliga PD patofysiologi.

Detta nya protokoll sysselsätter placeringen av en ligatur runt flera maxillary molar tänder med hjälp av instrumentering och material som finns inom de flesta laboratorier. Det tillåter en tillräcklig mängd tid för att enkelt och tryggt installera en ligatur som sannolikt inte kommer att avulse för tidigt. Slutligen, eftersom PMNs samordnar förstörelsen av den i PD, en ny metod för att återvinna orala neutrofiler på ett sätt som liknar människor presenteras också.

Protocol

Alla murina studier uppfyllde de relevanta etiska föreskrifterna och godkändes av University of Toronto djur vårds nämnd och forskningsetik nämnden (protokoll 20011930). 1. ligatur installation Anmärkning: Detta är en icke-sterila kirurgiska ingrepp som kan utföras i en Standard Operating Theater. Användningen av bakteriefria djur (som inte omfattas här) mandat hantering inom ett biosäkerhetsskåp, användning av sterila instrument, och inympning av munhål…

Representative Results

Representativa flödescytometri data från orala sköljprover av en naiv (figur 3a) och inflammerad (figur 3B) murina munhålan sekundärt till ligatur-inducerad parodontit tillhandahålls. Indrivningen av PMNs från en installerad ligatur påvisas också (figur 3C). Flow flödescytometerns kanal spänningar kalibrerades manuellt, och kompensation utfördes med enfärgade ersättnin…

Discussion

Den mest kritiska elementet i samband med användning av murina ligatur-inducerad modell av parodontit är centrerad kring retention av ligatur fram till tidpunkten för uppoffring eller avsiktlig avlägsnande. Den installerade biofilm-glans ligatur kan inducera en betydande förlust av alveolära benhöjd på så få som 6 dagar, plateauing mellan 11 – 16 dagars period³⁹. Beslutet att offra djur försökspersoner innan den maximala perioden av benförlust, vilket gör detta till en mycket korta…

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody	BioLegend	123131	BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice	Charles River		8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Conical Centrifuge Tube	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Multiple		1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Model 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Heat Therapy Pump	Hallowell		HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer	Electron Microscopy Sciences	66118-10	Germinator 500
Iris Scissors	Almedic	7602-A8-684	Straight
Ketamine	Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Mouse Serum	Sigma	M5905-5ML
Nylon Mesh Filter	Fisher Scientific	22-363-547	40 µm
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	28908	16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline	Sigma	D1408-500ML	Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes	BD	309659	1 mL
Rat Serum	Sigma	R9759-5ML
Silk Suture	Covidien	SS652	C13 USP 5-0
Splinter Forceps	Almedic	7726-A10-700	#1
Splinter Forceps	Almedic	7727-A10-704	#5
Stereo Dissecting Microscope	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle	BD	305111	26G X 1/2"
Syringe	BD	309659	1 mL
Xylazine	Rompun		20mg/mL