Summary
La combinaison de l'étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l'immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d'éthyle, et l'imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.
Abstract
Les techniques de compensation optique rendent le tissu transparent en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour la formation image tridimensionnelle (3-D) subséquente. Ils ont reçu une grande attention dans tous les domaines de recherche pour le potentiel d'analyser les structures microscopiques multicellulaires qui s'étendent sur des distances macroscopiques. Étant donné que les tubules de rein, la vascularisation, les nerfs, et le glomeruli s'étendent dans beaucoup de directions, qui ont été seulement partiellement capturées par les techniques bidimensionnelles traditionnelles jusqu'ici, dégagement de tissu a également ouvert de nombreux nouveaux secteurs de la recherche de rein. La liste des méthodes de compensation optique s'allonge rapidement, mais il reste difficile pour les débutants dans ce domaine de choisir la meilleure méthode pour une question de recherche donnée. Fourni ici est une méthode simple qui combine l'étiquetage des anticorps des tranches de rein de souris épaisses; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi; et l'imagerie confocale. Ce protocole décrit comment perfuter les reins et utiliser une étape de récupération d'antigène pour augmenter la liaison des anticorps sans avoir besoin d'équipement spécialisé. Son application est présentée dans l'imagerie de différentes structures multicellulaires dans le rein, et comment dépanner la pénétration des anticorps pauvres dans les tissus est abordée. Nous discutons également des difficultés potentielles de l'imagerie fluorophores endogènes et l'acquisition de très grands échantillons et comment les surmonter. Ce protocole simple fournit un outil facile à installer et complet pour étudier les tissus en trois dimensions.
Introduction
L'intérêt croissant pour l'étude d'organes entiers ou de grandes structures multicellulaires a conduit au développement de méthodes de compensation optique qui impliquent l'imagerie de tissus transparents en trois dimensions. Jusqu'à récemment, les meilleures méthodes pour estimer le nombre, la longueur ou le volume des structures entières étaient la stérilisation ou la section sérielle exhaustive, qui est basée sur l'échantillonnage systémique des tissus pour l'analyse ultérieure en deux dimensions1, 2 (en) , 3. Cependant, ces méthodes prennent beaucoup de temps et nécessitent un niveau élevé de formation et d'expertise4. Les méthodes de compensation optique surmontent ces problèmes en équilibrant l'indice de réfraction dans l'ensemble d'un échantillon pour rendre les tissus translucides pour l'imagerie 3D5,6,7.
Plusieurs méthodes de compensation optique ont été développées qui se divisent en deux grandes catégories : les méthodes à base de solvants et les méthodes aqueuses. Les méthodes aqueuses peuvent être encore divisées en immersion simple8,9, hyperhydratation10,11, et hydrogel encastrer12,13. Les méthodes à base de solvant déshydratent le tissu, enlèvent les lipides et normalisent l'indice de réfraction à une valeur d'environ 1,55. Les limites de la plupart des méthodes à base de solvants sont l'étanchéité de la fluorescence endogène des protéines journaliste couramment utilisées telles que le GFP, la toxicité des solvants, la capacité de dissoudre les colles utilisées dans certaines chambres d'imagerie ou lentilles objectives, et le rétrécissement des tissus pendant déshydratation14,15,16,17,18,19,20,21. Cependant, les méthodes basées sur les solvants sont simples, efficaces en temps, et peuvent fonctionner dans un certain nombre de différents types de tissus.
Les méthodes aqueuses s'appuient sur l'immersion du tissu dans des solutions aqueuses qui ont des indices réfractifs de l'ordre de 1,38-1,528,11,12,22,23,24 . Ces méthodes ont été développées pour préserver l'émission endogène de protéines fluorescentes de reporter et pour empêcher le rétrécissement déshydraté-induit, mais les limites de la plupart des méthodes aqueuses-basées de compensation incluent une plus longue durée du protocole, l'expansion de tissu, et modification des protéines (c.-à-d. dénaturation partielle des protéines par urée dans des protocoles hyperhydratants tels que ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS a abordé l'expansion des tissus en combinant l'urée avec le sorbitol, qui contrebalance par déshydratation l'expansion des tissus induites par l'urée, et a préservé l'ultrastructure tissulaire telle qu'évaluée par microscopie électronique10. Le rétrécissement ou l'expansion des tissus affecte la taille absolue des structures, les distances entre les objets ou la densité cellulaire par volume; ainsi, la mesure des changements de taille au nettoyage du tissu peut aider à interpréter les résultats obtenus7,26.
En général, un protocole de compensation optique se compose de plusieurs étapes, y compris le prétraitement, la perméabilisation, l'immunoétiquetage (si nécessaire), l'appariement de l'indice réfractif et l'imagerie avec microscopie lumineuse avancée (p. ex. deux photons, confocal, ou microscopie de fluorescence par feuille de lumière). La plupart des approches de compensation ont été développées pour visualiser le tissu neuronal, et des études émergentes ont validé leur application dans d'autres organes5. Cet outil complet a été précédemment démontré pour permettre l'analyse fiable et efficace des structures rénales, y compris glomeruli27,28, immunisé infiltre28, vascularisation28, et les segments tubule 29, et c'est une approche idéale pour améliorer la compréhension de la fonction glomerulaire et le remodelage de tubule dans la santé et la maladie.
Résumé ici est une méthode à base de solvant qui combine l'immunostaining des tubules rénaux; compensation optique avec cinnamate d'éthyle chimique bon marché, non toxique et prêt à l'emploi (ECi); et l'imagerie par microscopie confocale qui permet une visualisation et une quantification complètes des tubules. Cette méthode est simple, combine la récupération d'antigènes de tranches de rein avec la coloration d'anticorps commerciaux, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé, ce qui le rend accessible à la plupart des laboratoires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, États-Unis, et les autorités locales compétentes à Aix-la-Chapelle, en Allemagne.
1. Perfusion aortique abdominale rétrograde et fixation des reins de souris
- Préparer les solutions le même jour ou le soir avant et conserver dans un réfrigérateur pendant la nuit. Solutions chaudes à température ambiante (RT) avant de l'utiliser.
-
Faire un nouveau lot de paraformaldéhyde (PFA) de 3 % en saline tamponnée de phosphate 1x (PBS). Environ 50-100 mL DE PFA est nécessaire par souris.
- Pour faire 1 L de 3% PFA: Peser 30 g de PFA et ajouter 800 ml d'eau distillée dans le capot de fumée. Remuer et chauffer à 50-60 oC. Ne pas chauffer au-dessus de 70 oC.
CAUTION: PFA est toxique. Préparer pfA dans le capot de fumée. - Ajouter lentement plusieurs gouttes de 2N NaOH. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que PFA entre dans la solution ou ajouter quelques gouttes de plus. Certains petits morceaux ne se dissolvent pas.
- Retirer la solution du feu. Ajouter 50 ml de 20x PBS. Refroidir sur la glace à RT.
- Ajuster le pH à 7,3-7,4 avec HCl. Ajouter de l'eau distillée à 1 L.
- Enlever toutes les particules non dissoutes en filtrant 1x PBS et 3% PFA avec un filtre de 0,22 m.
- Pour faire 1 L de 3% PFA: Peser 30 g de PFA et ajouter 800 ml d'eau distillée dans le capot de fumée. Remuer et chauffer à 50-60 oC. Ne pas chauffer au-dessus de 70 oC.
- Ajouter 1 000 unités d'héparine à 1 L de 1x PBS. Transférer 1x PBS contenant de l'héparine et 3% de PFA dans 1x PBS dans des seringues en plastique séparées de 50 ml.
REMARQUE: Si disponible, la pompe à pression contrôlée fixée à 80-100 mmHg ou la pression hydrostatique (méthode d'égouttement, la hauteur des solutions de perfusion : 160-200 cm au-dessus de l'animal) peut être utilisée pour la perfusion rénale. - Connectez le PBS, le PFA et une aiguille de papillon émoussée de 21 G à un stopcock à trois voies. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans l'ensemble du système.
- Étiqueter un tube conique de 15 ml et y distribuer 10 ml de PFA.
- Anesthésiez profondément un mâle ou une femelle C57BL/6 souris 12-24 semaines d'âge en utilisant 120 mg/kg de kétamine et 16 mg/kg de xylazine. L'animal doit être vérifié pour l'absence complète de réactivité en pinçant les réflexes avant de procéder à la chirurgie (par exemple, réflexe de pincement d'orteil).
- Une fois que l'animal a atteint un plan chirurgical d'anesthésie, placez-le sur son dos sous le microscope disséquant. Ouvrez chirurgicalement l'abdomen avec une incision abdominale de midline utilisant des ciseaux d'opération et exposez l'aorte abdominale.
- Clamp l'aorte abdominale juste au-dessus de la ramification à l'artère iliaque avec un hemostat courbé. Puis serrer l'aorte abdominale juste en dessous des artères rénales avec un micro serrefine. Faire une petite incision (1 mm) sur l'aorte abdominale entre les deux pinces avec des ciseaux vannas. Insérez l'aiguille de papillon dans l'incision lentement et faites attention de ne pas déchirer l'aorte abdominale ouverte.
- Ligate l'artère rénale droite avec une suture de soie 5-0 et enlever le rein droit pour une autre analyse si un seul rein est nécessaire pour la perfusion et la fixation.
- Retirez la micro serrefine, transectez la veine du portail avec des ciseaux vannas, et perfillez immédiatement avec 50 ml de PBS contenant de l'héparine, puis changez et perflez avec 50 ml de 3 % de PFA.
REMARQUE: Une pression de perfusion élevée par l'aorte abdominale est nécessaire pour ouvrir les tubules rénaux pour une meilleure diffusion des anticorps par le tissu. La perfusion par le cœur peut ne pas ouvrir les tubules rénaux. - Ramassez soigneusement le rein perfusé et évitez de perforer ou de presser le tissu.
- Retirer la capsule et couper le rein en tranches coronales de 1 mm d'épaisseur. Utilisez une matrice de trancheur (Table of Materials) pour normaliser l'épaisseur des tranches.
REMARQUE: Sinon, pensez à utiliser un vibratome. - Immerger les tranches de rein avec le PFA préparé dans le tube conique étiqueté de 15 ml.
- Distribuer 10 mL de PFA à un autre tube conique étiqueté de 15 ml. Rincer le stopcock à trois voies et l'aiguille papillon avec PBS avant de passer à la souris suivante.
- Effectuer la post-fixation pendant la nuit à RT à l'abri de la lumière.
2. Préparation des tissus et immunostaining
- Après la post-fixation, laver la tranche de rein deux fois avec 1x tampon de lavage (Table of Materials) pendant 1 h sur un rocker horizontal à RT.
- Effectuer la récupération d'antigène. Chauffer 300 mL de solution antigène démasquée 1x (Tcapable de matériaux) dans un bécher de 500 ml à 92-98 oC. Enfermer la tranche dans la cassette d'intégration perméable au tampon chauffé en remuant pendant 1 h à 92-98 oC. Retirer le bécher du feu et laisser refroidir à RT.
REMARQUE: Certains fournisseurs testent leurs anticorps pour l'application d'immunohistochimie et incluront une méthode suggérée de récupération d'antigène dans la feuille de données. Par conséquent, certaines épitopes peuvent nécessiter un tampon plus basique (p.p.ph 9). - Transférer la tranche dans 10 ml de tampon de lavage 1x avec 0,1% Triton X-100 et la roche pendant la nuit à RT. Laver les tranches 2x avec 10 ml de tampon de lavage 1x frais pour 1 h le lendemain.
- Diluer l'anticorps primaire dans 500 l de diluant normal d'anticorps (Tableau des matériaux). Commencez par une concentration de 1:50-1:100. Incorporer délicatement la tranche de rein dans un anticorps primaire dilué pendant 4 d à 37 oC.
REMARQUE: Étant donné que chaque anticorps a des propriétés uniques, la température pendant l'incubation des anticorps et les dilutions d'anticorps doivent être optimisées pour les sondes individuelles. Pour les contrôles secondaires d'anticorps seulement, incuber le tissu rénal dans le diluant sans anticorps primaire. Au lieu du diluant commercial d'anticorps, 1x PBS avec 0.1% Triton X-100 et 0.01% azide de sodium peuvent être employés. - Laver la tranche de rein dans 10 ml de 1x tampon de lavage pendant la nuit à RT avec un changement de tampon de lavage après 8 h.
- Diluer les anticorps secondaires (p. ex. 1:100 pour les anticorps secondaires conjugués par Alexa Fluor) dans 500 L de diluant normal d'anticorps. Incuber les tranches de rein dans des anticorps secondaires dilués pendant 4 jours à 37 oC. À partir de cette étape, protégez les tranches de rein de la lumière.
- Laver les tranches de rein dans 10 ml de 1x tampon de lavage pendant la nuit à RT avec un changement de tampon de lavage après 8 h.
3. Défrichement des tissus
- Transférer la tranche de rein à 5 ml d'éthanol 100% de haute qualité (Table of Materials) pendant 2 h à RT avec bascule douce (avec un changement à l'éthanol frais après 1 h). Cette étape est pour la déshydratation des tissus.
REMARQUE: L'éthanol de haute qualité est nécessaire pour atteindre une translucidité de tissu élevée dans l'étape suivante. Le méthanol ou le tétrahydrofuran sont des réactifs de déshydratation alternatifs à fort potentiel de délipidation. - Immerger tranche de rein dans 2 ml d'ECi (Table of Materials) avec bascule douce à RT (avec un changement à ECi frais après 2 h) pendant la nuit.
REMARQUE: Le point de congélation/fusion de l'ECi est de 6 à 8 oC. Par conséquent, ne pas stocker les échantillons dans le réfrigérateur. Conduisez l'immersion dans une hotte de fumée correctement ventilée et évitez le contact direct avec les vêtements et la peau (ECi est un composé non toxique approuvé par la Food and Drug Administration, mais a une forte odeur). Utilisez des tubes eppendorf réguliers ou des récipients en verre (pas de récipients en polystyrène). - La translucidité tissulaire peut être atteinte après l'immersion d'ECi et lorsque les tranches de rein sont prêtes pour l'imagerie.
4. ConfocalImaging et analyse d'image
REMARQUE: Pour l'imagerie, d'autres techniques de microscopie peuvent être utilisées tant que la solution de correspondance de l'indice réfractif est compatible avec la lentille objective. Ce protocole utilise un microscope confocal inversé.
- Ajouter 600 à 1 000 l d'ECi dans le plat en verre (Tableaudes matériaux).
REMARQUE: Évitez d'utiliser des plats réguliers de culture cellulaire, car eCi est un solvant organique qui va dissoudre les plats en plastique. De même, ECi pourrait attaquer les pièces en plastique / anneaux d'isolation sur les lentilles objectives. Consultez les rapports appropriés pour un aperçu des plats d'imagerie compatibles30 et des chambres imprimées 3D autofaites28. - Transférer la tranche de rein translucide dans le plat. Placer un bordereau rond sur la tranche de rein pour appliquer une légère pression vers le fond de verre. Sceller le plat avec du film de paraffine (Table of Materials) pour éviter les fuites d'ECi.
REMARQUE: Des organes entiers ou plusieurs tranches de tissu d'épaisseur millimétrique peuvent nécessiter une bordure (ciment dentaire ou élastomère de silicone; voir Tableau des matériaux)autour du tissu pour faire un eCi-pool pour l'échantillon. - Placer le plat sur la plate-forme d'imagerie au microscope.
- Prenez plusieurs z-stacks et effectuez la couture. Commencez par une taille z-step de 5 m.
REMARQUE: Envisagez d'utiliser de longues distances de travail (à partir de 5 mm) et des objectifs d'ouverture numérique élevée (0,9) pour l'imagerie de tranches ou d'organes de tissus très épais. Après l'imagerie, transférer le tissu à l'éthanol et le stocker dans un tampon de lavage ou un PBS avec 0,02 % d'azide de sodium. - Analyser l'image à l'aide du rendu 3D avec un logiciel (Tableau des matériaux).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les reins sont des organes complexes composés de 43 types de cellules différents31. La plupart de ces cellules forment de grandes structures multicellulaires telles que le glomeruli et les tubules, et leur fonction dépend fortement des interactions les unes avec les autres. Les techniques histologiques classiques 2D capturent partiellement ces grandes structures et peuvent manquer des changements focaux dans les structures intactes31. Ainsi, l'analyse 3D utilisant des techniques de compensation optique aide à comprendre comment ils fonctionnent dans la santé et la maladie.
La plupart des techniques de compensation optique à base de solvants étancheront au moins partiellement le signal endogène de protéine fluorescente de journaliste. L'étanchéité du Parvalbumin marqué par le FPJ a été observée lors de la déshydratation et de la compensation optique avec ECi (Figure 1). Cependant, d'autres protéines fluorescentes fortes peuvent résister à l'étanchéité du signal, et l'ajustement du pH aux niveaux de base (pH 8-11) peut stabiliser les protéines fluorescentes endogènes14,20,28,30. En outre, des méthodes aqueuses devraient être envisagées si la préservation des émissions de protéines fluorescentes est souhaitée. Dans le présent rapport, il est démontré que ce protocole de compensation à base de solvants est compatible avec l'étiquetage des anticorps; bien que, il reste difficile d'atteindre l'immunolabeling profond du tissu, particulièrement dans un organe cellulaire-riche dense tel que le rein.
La perfusion aortique abdominale rétrograde des reins a ensuite été effectuée pour enlever les cellules sanguines et ouvrir les tubules (Figure 2A,B). Cette approche diminue l'autofluorescence et améliore la diffusion des anticorps. La concentration des anticorps dépend de la taille des tissus et de l'abondance de l'antigène. Par conséquent, le signal superficiel peut se rapporter soit à une faible pénétration des anticorps ou une quantité insuffisante d'anticorps (Figure 3A,B, voir aussi Film 1). Pour les grands échantillons ou les marqueurs extrêmement abondants, des concentrations plus élevées d'anticorps et le réapprovisionnement des anticorps après 1-2 jours peuvent être nécessaires. Si l'antigène d'intérêt est exprimé dans la vascularisation rénale, la livraison intravasculaire de l'anticorps doit être considérée (figure 3C). Cependant, les anticorps ciblant les protéines dans la membrane apicale des cellules épithéliales tubule ne franchissent pas la barrière de filtration glomerulaire en raison de la taille moléculaire, causant ainsi des signaux non spécifiques dans les vaisseaux sanguins et les glomeruli (Figure 3D).
Ce protocole peut être appliqué aux tranches de rein ou aux reins entiers (figure4A,B). Pour tester la spécificité des anticorps, seuls les témoins ont été soumis à des anticorps secondaires (figure 4C). Le tissu peut être étiqueté avec des anticorps pour détecter une population cellulaire spécifique (p. ex., cellules proliférantes, figure 4D) ou pour visualiser des segments entiers de tubule à l'aide d'anticorps spécifiques à un segment (figure 4E). De plus, la combinaison de plusieurs anticorps permet de colocaliser différentes protéines en 3D (p. ex., pour détecter l'hyperplasie des tubules spécifiques à un segment telle qu'elle se produit dans le remodelage des tubules sur différents stimuli) (figure4F,G; voir aussi Movie 2).
Figure 1 : Quenching du signal fluorescent endogène de protéine de journaliste. (A) La protéine endogène fluorescente de journaliste dérivée de la souris transgénique ParvalbuminYFPMDest détectable dans des sections de rein congelées PFA-fixes de 5 m d'épaisseur. Les flèches marquent des cellules parvalbumines étiquetées fluorescentes situées dans la première partie du tubule alambiqué distal. (B) Aucun signal fluorescent évident après le dégagement optique du tissu rénal n'est observé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Évaluation de la qualité de perfusion rénale. (A) Tissu incorporé paraffine à l'acide périodique (PAS) (5 sections minces de 5 m) montre peu de tubules avec un lumen légèrement ouvert (généralement des tubules proximales qui possèdent une bordure de brosse; voir flèches). (B) Tous les tubules sont ouverts après une bonne perfusion rénale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Dépannage de l'immunoétiquetage à monture entière. (A,B) Une tranche de rein épaisse a été tachée avec un anticorps contre le cotransporter-2 de sodium-chlorure-2 (NKCC2), qui est exprimé dans le membre ascendant épais de la boucle de Henle. Le signal est détectable à la surface du tissu (flèches dans (B)). Cependant, l'anticorps n'a pas pénétré dans le tissu [voir pointe de flèche dans (B)]. (C) Les protéines de ciblage par injection d'anticorps intravasculaires exprimées dans les vaisseaux (p. ex., CD31) permettent une coloration rapide et homogène des vaisseaux sanguins. Les structures rondes avec un signal fort sont glomeruli. (D) Cependant, les anticorps ciblant les protéines exprimées dans la membrane apicale de tubule épithélia (p. ex., le cotransporter phosphorylé de sodium-chlorure (phospho-NCC) qui s'exprime dans le tubule alambiqué distal) ne traverseront pas le glomerulaire barrière de filtration, causant ainsi des signaux non spécifiques dans la vascularisation (voir pointe de flèche pointant vers des artérioles afférentes et d'autres vaisseaux) et des glomeruli (voir flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats représentatifs du tissu rénal immunolabeled optiquement dégagé. (A,B) Ce protocole permet le dégagement optique de tout le rein. (C) Une pile z représentative pour montrer l'absence de liaison non spécifique de l'anticorps secondaire comme contrôle sans incubation préalable. (D) visualisation 3D d'un z-stack représentatif montre la prolifération de la bromodeoxyuridine (BrdU)- cellules dans la médulle rénale. (E) Les conduits de collecte médullaires sont visualisés à l'aide d'un anticorps contre l'aquaporine-2 (AQP2). (F,G) ) Analyse et quantification des cellules BrdUdans les canaux de collecte de l'AQP2et médullaires. Pour (F,G), voir aussi Film 2. Ce chiffre a été modifié à partir de Saritas et coll.29. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Film 1 (Lié à la figure3) : visualisation 3D de NKCC2-épais membre ascendant de la boucle de Henle. Le film démontre une mauvaise pénétration des anticorps dans une tranche de rein optiquement effacée. Veuillez cliquer ici pour télécharger la vidéo.
Film 2 (Lié à la figure4) : visualisation 3D des cellules BrdUetAQP2-conduits de collecte médullaires dans une tranche de rein éclaircie optiquement. Les cellules BrdUet AQP2et les conduits de collecte médullaires (en vert) sont présentés. Des algorithmes de tache et de surface d'Imaris ont été employés pour déterminer BrdU- cellules à l'extérieur (taches turquoise) ou à l'intérieur (taches roses) AQP2ettubules (surfaces vertes). Ce film est apparu à l'origine dans Saritas et al. 29. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger la vidéo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les techniques de compensation optique ont reçu une grande attention pour la visualisation 3D et la quantification de la microanatomie dans divers organes. Ici, la méthode de compensation solvant-basée (ECi) a été combinée avec l'immunolabeling pour l'imagerie 3-D des tubules entiers dans des tranches de rein. Cette méthode est simple, peu coûteuse et rapide. Cependant, d'autres questions de recherche peuvent être mieux répondues avec d'autres protocoles de compensation5. Il est également important de garder à l'esprit que les méthodes à base de solvants causent le rétrécissement des tissus à des degrés variables, principalement en raison de l'étape de déshydratation14,18. La plupart des méthodes à base de solvants (p. ex. ECi14) éteindnt également au moins partiellement la fluorescence endogène de journalistes tels que GFP ou tdTomato; ainsi, FDISCO32, CLARITY12, ou CUBIC11 peut servir de protocoles alternatifs. Cependant, l'effet d'étanchéité de l'ECi est variable et dépend des constructions individuelles de chaque souris journaliste28. En outre, l'utilisation de 1) un anticorps fluorescent contre GFP et d'autres reporters ou 2) des protocoles modifiés à base de solvants qui préservent les signaux de fluorescence endogène30,32 peuvent également être une approche alternative dans ce contexte. Il convient de mentionner que plusieurs groupes ont testé la compatibilité des protocoles aqueux24,33,34 pour visualiser l'ARN en 3D, tandis que les méthodes de compensation à base de solvants n'ont pas encore été testées. Ainsi, les méthodes de compensation aqueuses telles que la version modifiée de CLARITY33 devraient être préférées lorsque l'analyse de l'ARN est envisagée.
Les cellules ou les produits géniques d'intérêt peuvent être visualisés à l'aide de souris transgéniques avec une expression endogène de protéines fluorescentes, mais la génération de lignées de souris génétiquement modifiées est longue et coûteuse. Par conséquent, l'étiquetage des anticorps est plus pratique et offre plus de flexibilité, bien que l'immunolabeling de grands tissus soit difficile. Contrairement au protocole ECi14original, notre approche combine une méthode de compensation optique ECi modifiée et l'immunolabeling, qui utilise une étape de récupération d'antigène. L'antigène-récupération induit par la chaleur dénaturera les protéines, mais aide à récupérer la perte d'antigénicité pendant la fixation35 de PFA et améliore la liaison d'anticorps.
Il y a quelques étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, il est important d'effectuer une bonne perfusion du rein. L'hémoglobine contenant des globules rouges limite la profondeur d'imagerie7 et les tubules élargis avec lumen ouvert améliorent la pénétration des anticorps. L'ouverture des tubules permet également de mieux distinguer les protéines exprimées dans la membrane épithéliale apical d'autres protéines apiquement exprimées du côté contralatéral. Cependant, les tubules artificiellement étendus peuvent influencer négativement la structure de tubule et masquer la réponse pathophysiologique spécifique du rein (par exemple dilatation des tubules proximales blessés,) mais pas des tubules sains36. Deuxièmement, l'incubation d'anticorps à 37 oC au lieu de 4 oC ou RT améliore la pénétration des anticorps27. Cependant, chaque anticorps a des propriétés uniques; ainsi, la température pendant l'incubation d'anticorps doit être optimisée pour les sondes individuelles. Troisièmement, l'utilisation d'anticorps secondaires Alexa Fluor-647 (spectre rouge lointain) contribue à augmenter le rapport signal-bruit, d'autant plus que les reins émettent une grande quantité d'autofluorescence dans le spectre bleu-vert37.
L'injection rétro-orbitale14 ou perfusion de rein38 avec des anticorps conjugués au fluorophore contre les protéines exprimées dans les vaisseaux sanguins est un moyen élégant et rapide d'étiqueter la vascularisation des reins. Cependant, les protéines dans la membrane apicale des tubules restent inaccessibles par injection intravasculaire puisque les anticorps ne peuvent pas traverser la barrière de filtration glomerulaire avec son poids moléculaire de coupure pour la filtration des protéines dans la gamme de 60-65 kDa. Par conséquent, l'utilisation de petits fragments d'anticorps et de variantes modifiées telles que des fragments de Fab (55 kDa), des diabodies (50 kDa), des scFv en tandem (28 kDa) ou des aptamères à l'acide nucléique (6 à 30 kDa) avec des propriétés de reconnaissance moléculaire préservées des anticorps peut fournir un l'occasion d'accéder à la membrane apicale des tubules38,39. En outre, la combinaison de petits fragments d'anticorps avec des champs électriques40 ou pression13 ou l'utilisation de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) à base de protocoles de compensation pour enlever les lipides24,41,42 peut permettre une pénétration rapide et efficace des anticorps des tissus.
Plusieurs groupes ont démontré que la perfusion avec le réactif de compensation réduit non seulement le temps de protocole, mais augmente également la transparence de tissu19,24,43,44. Par conséquent, cannulation de l'aorte abdominale ou de l'artère rénale avec perfusion suivante du rein avec des solutions d'appariement d'index déshydratants et réfractifs devraient être considérés pour réaliser une meilleure et plus rapide compensation de tissu. Cependant, nous n'avons pas perfusé le rein entier avec des réactifs de compensation et avons employé les reins tranchés pour plusieurs raisons. Tout d'abord, différents antigènes peuvent être visualisés par l'étiquetage des anticorps de plusieurs tranches de rein d'un rein. Deuxièmement, moins de temps et d'anticorps sont nécessaires pour effectuer l'immunoétiquetage d'une tranche de rein par rapport à un rein entier. Troisièmement, l'imagerie 3D de gros échantillons génère des ensembles de données jusqu'à plusieurs téraoctets, ce qui peut être difficile à gérer pour la plupart des postes de travail. Par conséquent, les données provenant de tranches de tissu ou de sous-ensembles de fichiers plus importants sont plus pratiques pour effectuer des opérations complexes telles que le comptage automatisé ou les mesures de distance.
Dans ce protocole, la microscopie confocale est utilisée pour effectuer l'imagerie avec une résolution unicellulaire, ce qui est particulièrement pertinent dans les études de colocalisation. Cependant, l'imagerie confocale nécessite un balayage laser, puisque sa vitesse d'imagerie n'est pratique que pour les petits morceaux de tissu défriché. Pour effectuer une analyse morphométrique 3D des structures multicellulaires telles que de longs segments de tubule ou même des organes entiers, des techniques de microscope plus rapides telles que des microscopes fluorescents par feuille de lumière (LSFM) sont nécessaires. LSFM permet une imagerie rapide lorsque la résolution cellulaire la plus élevée n'est pas essentielle. Par exemple, les longueurs des tubules alambiqués distales ont été récemment évaluées en combinant l'immunolabeling de monture entière, la compensation optique basée sur CLARITY12, et LSFM29. Malheureusement, le LSFM commercial est coûteux et pas toujours compatible avec les protocoles de compensation à base de solvants. En fait, CLARITY a été choisi pour cette étude, puisque notre LSFM particulier avec un objectif personnalisé pour CLARITY n'était pas compatible avec ECi29. Toutefois, Klingberg et coll. ont démontré qu'ECi est en principe compatible avec le LSFM14.
En conclusion, une méthode simple de compensation optique basée sur l'ECi est démontrée, qui peut être appliquée à n'importe quel projet de recherche à l'aide de tranches de tissu fixes allant de 100 à plusieurs millimètres d'épaisseur. Il permet également des analyses réalisables qui nécessitaient auparavant des efforts presque exhaustifs pour mener à bien, et élimine les hypothèses et les inférences requises associées à l'analyse bidimensionnelle de la morphologie. La combinaison de l'immunolabeling de montage entier, de compensation optique, et de la microscopie légère avancée aidera à faire avancer la compréhension de la fonction cellulaire dans la santé et la maladie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
T. S. est soutenu par des subventions de la DFG German Research Foundation (332853055), else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197), et de la Faculté de médecine de la RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. est soutenu par des bourses de recherche de la Deutsche Gesellschaft fourrure Nephrologie, la Fondation Alexander von Humboldt, et le National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E est soutenu par la Fondation LeDucq. R. K. est soutenu par des subventions du DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de l'État de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) et du Centre interdisciplinaire de recherche clinique de l'Université RWTH Dachen (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al.
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M.
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
