Summary
La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.
Abstract
Le tecniche di compensazione ottica rendono trasparente il tessuto bilanciando l'indice di rifrazione in un campione per la successiva imaging tridimensionale (3D). Hanno ricevuto grande attenzione in tutte le aree di ricerca per il potenziale di analizzare strutture multicellulari microscopiche che si estendono su distanze macroscopiche. Dato che i tubuli renali, la vascolatura, i nervi e i glomeruli si estendono in molte direzioni, che finora sono stati catturati solo parzialmente dalle tradizionali tecniche bidimensionali, la pulizia dei tessuti ha aperto anche molte nuove aree di ricerca sui reni. L'elenco dei metodi di compensazione ottica è in rapida crescita, ma rimane difficile per i principianti in questo campo scegliere il metodo migliore per una determinata domanda di ricerca. Fornito qui è un metodo semplice che combina l'etichettatura anticorpale di fette di rene di topo spesse; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso; e l'imaging confocale. Questo protocollo descrive come perfondere i reni e utilizzare un passaggio di recupero dell'antigene per aumentare il legame degli anticorpi senza richiedere attrezzature specializzate. La sua applicazione è presentata nell'imaging di diverse strutture multicellulari all'interno del rene, e come risolvere la scarsa penetrazione degli anticorpi nel tessuto è affrontato. Discutiamo anche delle potenziali difficoltà dell'imaging dei fluorofori endogeni e dell'acquisizione di campioni molto grandi e di come superarli. Questo semplice protocollo fornisce uno strumento facile da configurare e completo per studiare il tessuto in tre dimensioni.
Introduction
Il crescente interesse nello studio di interi organi o di grandi strutture multicellulari ha portato allo sviluppo di metodi di compensazione ottica che coinvolgono l'imaging di tessuto trasparente in tre dimensioni. Fino a poco tempo fa, i metodi migliori per stimare il numero di cellule, la lunghezza o il volume di intere strutture sono stati la stereologia o il sezionamento seriale esaustivo, che si basa sul campionamento sistemico del tessuto per l'analisi successiva in due dimensioni1, 2 Il nome del sistema , 3. Tuttavia, questi metodi richiedono molto tempo e necessitano di un elevato livello di formazione e competenza4. I metodi ottici di compensazione superano questi problemi bilanciando l'indice di rifrazione in tutto un campione per rendere il tessuto traslucido per l'imaging 3D5,6,7.
Sono stati sviluppati diversi metodi di compensazione ottica che rientrano in due categorie principali: metodi basati su solventi e acquosi. I metodi basati su aqueous possono essere ulteriormente suddivisi in semplice immersione8,9, iperidratazione10,11e idrogel incorporando12,13. I metodi a base di solvente disidratano il tessuto, rimuovono i lipidi e normalizzano l'indice di rifrazione a un valore intorno a 1,55. Limitazioni della maggior parte dei metodi a base di solventi sono la dorching della fluorescenza endogena di proteine reporter comunemente usate come GFP, tossicità dei solventi, capacità di sciogliere le colle utilizzate in alcune camere di imaging o lenti oggettive, e il restringimento dei tessuti durante disidratazione14,15,16,17,18,19,20,21. Tuttavia, i metodi basati sui solventi sono semplici, efficienti in termini di tempo e possono funzionare in diversi tipi di tessuto.
I metodi basati su aqueous si basano sull'immersione del tessuto in soluzioni acquose che hanno indici di rifrazione nell'intervallo di 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Questi metodi sono stati sviluppati per preservare l'emissione di proteine endogeniche di reporter fluorescenti e prevenire il restringimento indotto dalla disidratazione, ma i limiti della maggior parte dei metodi di compensazione basati su acquosi includono una durata più lunga del protocollo, l'espansione dei tessuti e modificazione delle proteine (cioè denaturazione parziale delle proteine mediante urea in protocolli iperidratanti come ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS ha affrontato l'espansione dei tessuti combinando l'urea con il sorbitolo, che controbilancia per disidratazione l'espansione dei tessuti indotta dall'urea, e ha conservato l'ultrastruttura dei tessuti valutata dalla microscopia elettronica10. Il restringimento o l'espansione dei tessuti influisce sulle dimensioni assolute delle strutture, sulle distanze tra gli oggetti o sulla densità delle cellule per volume; pertanto, la misurazione delle dimensioni cambia al momento della compensazione del tessuto può aiutare a interpretare i risultati ottenuti7,26.
In generale, un protocollo per la compensazione ottica è costituito da più passaggi, tra cui pretrattamento, permeabilizzazione, immunolabeling (se necessario), corrispondenza dell'indice di rifrazione e imaging con microscopia luminosa avanzata (ad esempio, a due fotone, confocali o microscopia a fluorescenza del foglio luminoso). La maggior parte degli approcci di compensazione sono stati sviluppati per visualizzare il tessuto neuronale, e studi emergenti hanno convalidato la loro applicazione in altri organi5. Questo strumento completo è stato dimostrato in precedenza per consentire un'analisi affidabile ed efficiente delle strutture renali, tra cui glomeruli27,28, infiltrati immunitari28, vascolatura28e segmenti di tubulo 29, ed è un approccio ideale per migliorare la comprensione della funzione glomerare e del rimodellamento del tubulo in salute e malattia.
Riassunto qui è un metodo a base di solventi che combina l'immunostaining dei tubuli renali; sgombera ottica con cinnamate chimico a buon mercato, non tossico e pronto all'uso (ECi); e l'imaging a microscopia confocale che consente una visualizzazione completa del tubulo e la quantificazione. Questo metodo è semplice, combina antigene-recupero di fette di rene con colorazione di anticorpi commerciali, e non richiede attrezzature specializzate, che lo rende accessibile alla maggior parte dei laboratori.
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Protocol
NOT: Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon Health and Science University di Portland, Oregon, USA e dalle autorità locali competenti di Aquisto, in Germania.
1. Retrogrado Perfusione aortica addominale e fissazione dei reni del topo
- Preparare le soluzioni lo stesso giorno o sera prima e conservare in frigorifero durante la notte. Soluzioni calde alla temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
-
Fare un lotto fresco di 3% paraformaldeide (PFA) in 1x salina tampone fosfato (PBS). Sono necessari circa 50-100 mL PFA per mouse.
- Per fare 1 L del 3% PFA: Pesare 30 g di PFA e aggiungere 800 mL di acqua distillata nella cappa del fuma. Mescolare e riscaldare a 50-60 gradi centigradi. Non riscaldare al di sopra di 70 gradi centigradi.
AVVISO: il PFA è tossico. Preparare l'APE nella cofano dei fumi. - Aggiungere lentamente diverse gocce di 2N NaOH. Attendere qualche minuto fino a quando PFA entra nella soluzione o aggiungere qualche goccia in più. Alcuni piccoli pezzi non si dissolveranno.
- Togliere la soluzione dal fuoco. Aggiungere 50 mL di 20x PBS. Rilassare sul ghiaccio a RT.
- Regolare il pH a 7,3-7,4 con HCl. Aggiungere acqua distillata a 1 L.
- Rimuovere le particelle non dissolte filtrando 1x PBS e 3% PFA con filtro 0,22 m.
- Per fare 1 L del 3% PFA: Pesare 30 g di PFA e aggiungere 800 mL di acqua distillata nella cappa del fuma. Mescolare e riscaldare a 50-60 gradi centigradi. Non riscaldare al di sopra di 70 gradi centigradi.
- Aggiungere 1.000 unità di Eparin a 1 L di 1x PBS. Trasferire 1x PBS contenente eparina e 3% PFA in 1x PBS in siringhe di plastica da 50 mL separate.
NOT: Se disponibile, pompa a pressione controllata impostata a 80-100 mmHg o pressione idrostatica (metodo a goccia, l'altezza delle soluzioni di perfusione: 160-200 cm sopra l'animale) può essere utilizzato per la perfusione renale. - Collegare il PBS, PFA e un ago a farfalla 21 G smussato a un stopcock a tre vie. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nell'intero sistema.
- Etichettare un tubo conico da 15 mL e dispensare 10 mL di PFA.
- Anestesizzare profondamente un topo C57BL/6 maschio o femmina 12-24 settimane di età utilizzando 120 mg/kg di peso corporeo ketamina e 16 mg/kg di peso corporeo xylazina. L'animale deve essere controllato per la completa assenza di reattività pizzicando i riflessi prima di procedere alla chirurgia (ad esempio, riflesso pizzico di dita dei pipista).
- Una volta che l'animale ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, posizionarlo sulla schiena sotto il microscopio dissetante. Aprire chirurgicamente l'addome con un'incisione addominale mediana utilizzando una forbice operativa ed esporre l'aorta addominale.
- Stringere l'aorta addominale proprio sopra la ramificazione all'arteria iliaca con un emotoma curvo. Quindi bloccare l'aorta addominale proprio sotto le arterie renali con un micro serrefine. Fare una piccola incisione (1 mm) sull'aorta addominale tra i due morsetti con forbici vannas. Inserire lentamente l'ago della farfalla nell'incisione e fare attenzione a non strappare l'aorta addominale aperta.
- Ligate l'arteria renale giusta con una sutura di seta 5-0 e rimuovete il rene destro per altre analisi se è necessario un solo rene per la perfusione e la fissazione.
- Rimuovere il micro serrefine, transetto la vena del portale con le forbici vannas, e profumare immediatamente con 50 mL di PBS contenente eparina, quindi passare e perfondere con 50 mL di 3% PFA.
NOT: L'alta pressione perfusione attraverso l'aorta addominale è necessaria per aprire tubuli renali per una migliore diffusione degli anticorpi attraverso il tessuto. La perfusione nel cuore non può aprire tubuli renali. - Raccogliere il rene perfuso con attenzione ed evitare di forare o spremere il tessuto.
- Rimuovere la capsula e tagliare il rene in fette coronali spesse 1 mm. Utilizzare una matricedifiltro dei dati ( Tabella dei materiali ) per standardizzare lo spessore della sezione.
NOT: In alternativa, prendere in considerazione l'utilizzo di un vibratome. - Immergere le fette renali con il PFA preparato nel tubo conico da 15 mL etichettato.
- Distribuisci 10 mL di PFA a un altro tubo conico da 15 mL etichettato. Sciacquare l'ago a tre vie e l'ago delle farfalle con PBS prima di passare al mouse successivo.
- Effettuare post-fissaggio durante la notte presso RT protetti dalla luce.
2. Preparazione dei tessuti e immunostaining
- Dopo la post-fissazione, lavare la fetta renale due volte con 1x tampone di lavaggio (Tabella dei materiali) per 1 h su un rocker orizzontale a RT.
- Eseguire il recupero dell'antigene. Riscaldare 300 mL di 1x soluzione di smascheramento antigene (Tin grado dimateriali) in un becher da 500 mL a 92-98 gradi centigradi. Racchiudere la fetta in cassetta di incorporamento permeabile al cuscinetto riscaldato con agitazione per 1 h a 92-98 gradi centigradi. Togliere il becher dal fuoco e lasciarlo raffreddare a RT.
NOT: Alcuni fornitori testano i loro anticorpi per l'applicazione dell'immunoistochimica e includeranno un metodo di recupero dell'antigene suggerito nella scheda tecnica. Pertanto, alcuni epitopi potrebbero richiedere un buffer più semplice (ad esempio, pH 9). - Trasferire la fetta in 10 mL di 1x buffer di lavaggio con 0.1% Triton X-100 e rock durante la notte a RT. Lavare le fette 2x con 10 mL di tampone di lavaggio 1x fresco per 1 h il giorno successivo.
- Diluire l'anticorpo primario in 500 -L di normale diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Iniziare con una concentrazione di 1:50-1:100. Afmasse delicatamente la fetta renale in anticorpi primari diluiti per 4 d a 37 gradi centigradi.
NOT: Poiché ogni anticorpo ha proprietà uniche, la temperatura durante l'incubazione degli anticorpi e le diluizioni degli anticorpi devono essere ottimizzate per le singole sonde. Per i controlli secondari solo anticorpi, incubare il tessuto renale in diluente senza anticorpo primario. Invece di diluente anticorpo commerciale, 1x PBS con 0.1% Triton X-100 e 0.01% azide di sodio può essere utilizzato. - Lavare la fetta renale in 10 mL di 1x lavaggio durante la notte a RT con un cambio di tampone di lavaggio dopo 8 h.
- Diluire gli anticorpi secondari (ad esempio, 1:100 per gli anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor) in 500 - L di normale diluente anticorpo. Incubare le fette di rene in anticorpi secondari diluiti per 4 giorni a 37 gradi centigradi. Da questo passo in poi, proteggere le fette di rene dalla luce.
- Lavare le fette di rene in 10 mL di 1x lavare il buffer durante la notte a RT con un cambio di buffer di lavaggio dopo 8 h.
3. Cancellazione dei tessuti
- Trasferire la fetta renale a 5 mL di alto grado 100% etanolo (Tabella dei materiali) per 2 h a RT con dondolo delicato (con un passaggio all'etanolo fresco dopo 1 h). Questo passo è per la disidratazione dei tessuti.
NOT: L'etanolo di alto grado è necessario per ottenere un'elevata traslucenza tissutale nella fase successiva. Metanolo o tetraidrofuran sono reagenti di disidratazione alternativi con alto potenziale di delipidazione. - Immergere la fetta renale in 2 mL di ECi (Tabella dei Materiali) con dondolo delicato a RT (con un cambio di ECi fresco dopo 2 h) durante la notte.
NOT: Il punto di congelamento/fusione dell'ECi è di 6-8 gradi centigradi. Pertanto, non conservare i campioni in frigorifero. Condurre l'immersione in una cappa di fumi correttamente ventilata ed evitare il contatto diretto con i vestiti e la pelle (ECi è un composto non tossico approvato dalla Food and Drug Administration ma ha un forte odore). Utilizzare tubi Eppendorf regolari o recipienti di vetro (nessun recipiente in polistirolo). - La traslucenza dei tessuti può essere raggiunta dopo l'immersione ECi e quando le fette di rene sono pronte per l'imaging.
4. ConfocalImaging e analisi delle immagini
NOT: Per l'imaging, altre tecniche di microscopia possono essere utilizzate finché la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione è compatibile con l'obiettivo. Questo protocollo utilizza un microscopio confocale invertito.
- Aggiungete 600-1.000 l di ECi nella teglia di fondo in vetro (Tabella dei materiali).
NOT: Evitare l'uso di piatti di coltura cellulare regolari, perché ECi è un solvente organico che dissolverà i piatti di plastica. Allo stesso modo, ECi potrebbe attaccare parti in plastica / anelli di isolamento su lenti obiettive. Fare riferimento alle relazioni appropriate per una panoramica dei piatti di imaging compatibili30 e delle camere stampate 3D 3D28. - Trasferire la fetta renale traslucida nel piatto. Posizionare un coperchio rotondo sulla fetta renale per applicare una leggera pressione verso il fondo di vetro. Sigillare il piatto con pellicola di paraffina (Tabella dei materiali) per evitare perdite di ECi.
NOT: Organi interi o fette di tessuto spesse più millimetri possono richiedere un bordo (cemento dentale o elastomero in silicone; vedi Tabella dei materiali) intorno al tessuto per creare un eCi-pool per il campione. - Posizionare il piatto sulla piattaforma di imaging al microscopio.
- Prendere diversi z-stack ed eseguire cuciture. Iniziare con una dimensione z-step di 5 m.
NOT: Considerare l'utilizzo di obiettivi a lunga distanza di lavoro (>5 mm) e ad alta apertura numerica (>0,9) per l'imaging di fette o organi di tessuto molto spessi. Dopo l'imaging, trasferire il tessuto nell'etanolo e conservarlo in tampone o PBS con azide di sodio dello 0,02%. - Analizzare l'immagine utilizzando il rendering 3D con il software (Table of Materials).
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Representative Results
I reni sono organi complessi composti da 43 diversi tipi di cellule31. La maggior parte di queste cellule formano grandi strutture multicellulari come glomeruli e tubuli, e la loro funzione è fortemente dipendente dalle interazioni tra loro. Le tecniche istologiche classiche 2D catturano parzialmente queste grandi strutture e possono perdere cambiamenti focali all'interno di strutture intatte31. Pertanto, l'analisi 3D con tecniche di compensazione ottica aiuta a capire come funzionano in salute e malattia.
La maggior parte delle tecniche di compensazione ottica basate sui solventi placherà almeno parzialmente il segnale endogeno della proteina reporter fluorescente. Il quenching della Parvalbumin con etichettatura YFP è stato osservato al momento della disidratazione e della compensazione ottica con ECi (Figura 1). Tuttavia, altre proteine fluorescenti forti possono resistere al segnale-spegnimento, e la regolazione del pH ai livelli di base (pH 8-11) può stabilizzare le proteine fluorescenti endogene14,20,28,30. Inoltre, se si desidera la conservazione dell'emissione di proteine fluorescenti, è necessario considerare metodi acquosi a base di acquose. Nella presente relazione, è dimostrato che questo protocollo di compensazione basato su solventi è compatibile con l'etichettatura degli anticorpi; anche se, rimane difficile ottenere l'immunoetichettatura profonda del tessuto, soprattutto in un organo denso ricco di cellule come il rene.
La perfusione aortica addominale retrograda dei reni è stata poi eseguita per rimuovere le cellule del sangue e aprire i tumori (Figura 2A,B). Questo approccio riduce l'autofluorescenza e migliora la diffusione degli anticorpi. La concentrazione di anticorpi dipende dalle dimensioni del tessuto e dall'abbondanza dell'antigene. Pertanto, il segnale superficiale può riguardare una scarsa penetrazione degli anticorpi o una quantità insufficiente di anticorpi (Figura 3A,B, vedi anche Film 1). Per campioni di grandi dimensioni o marcatori estremamente abbondanti, possono essere necessarie concentrazioni più elevate di anticorpi e rifornimento di anticorpi dopo 1-2 giorni. Se l'antigene di interesse è espresso nella vascolatura renale, la somministrazione intravascolare dell'anticorpo deve essere considerata (Figura 3C). Tuttavia, gli anticorpi che prendono di mira le proteine nella membrana apicale delle cellule epiteliali del tubulo non attraversano la barriera di filtrazione glomerare a causa delle dimensioni molecolari, causando così segnali non specifici nei vasi sanguigni e glomeruli (Figura 3D).
Questo protocollo può essere applicato a fette di rene o reni interi (Figura 4A,B). Per testare la specificità degli anticorpi, solo i controlli sono stati sottoposti a anticorpi secondari (Figura 4C). Il tessuto può essere etichettato con anticorpi per rilevare una popolazione cellulare specifica (ad esempio, cellule che proliferano, Figura 4D) o per visualizzare interi segmenti di tubuli utilizzando anticorpi specifici del segmento (Figura 4E). Inoltre, la combinazione di più anticorpi offre l'opportunità di colocalizzare diverse proteine in 3D (ad esempio, per rilevare l'iperplasia del tubulo specifico del segmento come si verifica nel rimodellamento dei tubuli su diversi stimoli) (Figura 4F,G; vedere anche Film 2).
Figura 1: Daccio del segnale proteico endogeno fluorescente del reporter. (A) La proteina endogena reporter fluorescente derivata dal topo transgenico ParvalbuminYFPè rilevabile in 5 sezioni di rene congelati sottili come PFA. Le frecce segnano alcuni parvalbumina con etichetta fluorescente: cellule situate nella prima parte del tubulo contorto distale. (B) Non è stato osservato alcun segnale fluorescente evidente dopo lo sradicamento ottico del tessuto renale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione della qualità della perfusione renale. (A) Periodic Acid Schiff (PAS) -colorato tessuto incorporato di paraffina (5 sezioni sottili m) mostra pochi tubuli con un lume leggermente aperto (tipicamente tubuli prossimali che possiedono bordo pennello; vedi frecce). (B) Tutti i tubuli sono aperti dopo una buona perfusione renale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risoluzione dei problemi relativi all'immunoetichettatura a montaggio completo. (A,B) Una spessa fetta di rene è stata macchiata con un anticorpo contro il cotrasporto di sodio-cloruro-2 (NKCC2), che si esprime nell'arto ascendente spesso del ciclo di Henle. Il segnale è rilevabile sulla superficie del tessuto (frecce in (B)). Tuttavia, l'anticorpo non penetrava nel tessuto [vedere la punta della freccia in (B)]. (C) L'iniezione di anticorpi intravascolari mira alle proteine espresse nei vasi (ad esempio, CD31) consente una colorazione rapida e omogenea dei vasi sanguigni. Le strutture rotonde con un segnale forte sono glomeruli. (D) Tuttavia, gli anticorpi destinati alle proteine espressi nella membrana apicale dell'epitelio tubulo (ad esempio, il cotrasporto al sodio-cloruro al fosforo (phopho-NCC) che si esprime nel tubulo contorto disloccato) non attraverseranno il glomerare barriera filtrante, causando così segnali non specifici nella vascolatura (vedi punta di freccia che punta a arterie afferenti e altri vasi) e glomeruli (vedi frecce). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi del tessuto renale cancellato otticamente. (A,B) Questo protocollo consente lo sgombimento ottico dell'intero rene. (C) Uno z-stack rappresentativo che mostra l'assenza di legame non specifico dell'anticorpo secondario come controllo senza incubazione preventiva. (D) La visualizzazione 3D di uno z-stack rappresentativo mostra cellule di medulla renale proliferanti bromodeoxyuridina. (E) I dotti di raccolta medullari sono visualizzati utilizzando un anticorpo contro l'acquaporina-2 (AQP2). (F,G) Analisi e quantificazione delle cellule BrdU all'interno di AQP2- dotti di raccolta medullaria. Per (F,G), vedere anche Film 2. Questa cifra è stata modificata da Saritas et al.29. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Filmato 1 (Relativo alla Figura 3): visualizzazione 3D di NKCC2-spesso arto ascendente del ciclo di Henle. Il film dimostra una scarsa penetrazione degli anticorpi in una fetta renale cancellata otticamente. Clicca qui per scaricare il video.
Filmato 2 (relativo alla figura 4): visualizzazione 3D di BrdU-cellulee AQP2-medullary raccolta condotti in una fetta di rene eliminato otticamente. BrdU: vengono mostrate le celle (in rosso) e l'AQP2e i dotti di raccolta medullari (in verde). Gli algoritmi spot e di superficie dell'Imaris sono stati utilizzati per determinare gli algoritmi BrdU- cellule esterne (punti turchesi) o all'interno (macchie rosa) AQP2-tubuli (superfici verdi). Questo film è apparso originariamente in Saritas et al. 29. Fare clic qui per scaricare il video.
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Discussion
Le tecniche di compensazione ottica hanno ricevuto un'ampia attenzione per la visualizzazione 3D e la quantificazione della microanatomia in vari organi. In questo caso, il metodo di compensazione basato su solventi (ECi) è stato combinato con l'immunolabeling per l'imaging 3D di tubuli interi in fette di rene. Questo metodo è semplice, economico e veloce. Tuttavia, altre domande di ricerca possono essere meglio risolte con altri protocolli di compensazione5. È anche importante tenere a mente che i metodi basati su solventi causano restringimento dei tessuti a gradi variabili, principalmente a causa del passaggio di disidratazione14,18. La maggior parte dei metodi basati sui solventi (ad esempio, ECi14) anche almeno parzialmente dissegeno fluorescenza endogena di reporter come GFP o tdTomato; pertanto, FDISCO32, CLARITY12o CUBIC11 possono fungere da protocolli alternativi. Tuttavia, l'effetto di spegnimento di ECi è variabile e dipende dai singoli costrutti di ogni topo reporter28 . Inoltre, l'uso di 1) un anticorpo fluorescente contro GFP e altri reporter o 2) protocolli a base di solventi modificati che conservano i segnali di fluorescenza endogeni30,32 possono anche essere un approccio alternativo in questo contesto. Vale la pena ricordare che diversi gruppi hanno testato la compatibilità dei protocolli basati su acquosi24,33,34 per visualizzare l'RNA in 3D, mentre i metodi di compensazione basati su solventi non sono ancora stati testati. Pertanto, i metodi di compensazione basati su acquosi come la versione modificata di CLARITY33 dovrebbero essere preferiti quando si considera l'analisi dell'RNA.
Le cellule o i prodotti genici di interesse possono essere visualizzati utilizzando topi transgenici con espressione endogena di proteine fluorescenti, ma la generazione di linee di topo geneticamente ingegnerizzate richiede tempo e denaro. Pertanto, l'etichettatura degli anticorpi è più pratica e fornisce maggiore flessibilità, anche se l'immunolabeling dei tessuti di grandi dimensioni è impegnativo. A differenza del protocollo ECioriginale 14, il nostro approccio combina un metodo di compensazione ottica ECi modificato e immunolabeling, che utilizza un passo di recupero dell'antigene. Il recupero dell'antigene indotto dal calore denatura le proteine, ma aiuta a recuperare la perdita di antigenicità durante la fissazione PFA35 e migliora il legame degli anticorpi.
Ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, è importante eseguire una buona perfusione del rene. L'emoglobina contenente globuli rossi limita la profondità di imaging7 e i tubuli espansi con lumen aperto migliorano la penetrazione degli anticorpi. L'apertura dei tubuli permette anche una migliore distinzione delle proteine espresse nella membrana apile epiteliale da altre proteine apically espresse sul lato contralaterale. Tuttavia, i tubuli espansi artificialmente possono influenzare negativamente la struttura dei tubuli e mascherare la risposta paofisiologica specifica del rene (ad esempio la dilatazione dei tubuli prossimali feriti), ma non dei tubuli sani36. In secondo luogo, l'incubazione degli anticorpi a 37 gradi centigradi invece di 4 gradi centigradi o la RT migliora la penetrazione degli anticorpi27. Tuttavia, ogni anticorpo ha proprietà uniche; pertanto, la temperatura durante l'incubazione degli anticorpi deve essere ottimizzata per le singole sonde. In terzo luogo, l'uso di anticorpi secondari Alexa Fluor-647 (spettro di colore rosso) aiuta ad aumentare il rapporto segnale-rumore, soprattutto perché i reni emettono una grande quantità di autofluorescenza nello spettro blu-verde37.
L'iniezione retroorbitaria14 o la perfusione di rene38 con anticorpi coniugati con fluoroforo contro le proteine espresse nei vasi sanguigni è un modo elegante e veloce per etichettare la vascolatura renale. Tuttavia, le proteine nella membrana apicale dei tubuli rimangono inaccessibili per iniezione intravascolare poiché gli anticorpi non possono attraversare la barriera di filtrazione glomerare con il suo peso molecolare tagliato per la filtrazione delle proteine nell'intervallo di 60-65 kDa. Pertanto, l'uso di piccoli frammenti di anticorpi e varianti ingegnerizzate come frammenti di Fab (55 kDa), diacorpi (50 kDa), tandem scFv (28 kDa) o aptamers acidi nucleici (6-30 kDa) con proprietà molecolari conservate degli anticorpi può fornire un possibilità di accedere alla membrana apicale dei tubuli38,39. Inoltre, la combinazione di piccoli frammenti di anticorpi con campi elettrici40 o pressione13 o l'uso di protocolli di compensazione basati su sodio solfato dodecyl (SDS) per rimuovere i lipidi24,41,42 può consentire la penetrazione rapida ed efficiente degli anticorpi dei tessuti.
Diversi gruppi hanno dimostrato che la perfusione con il reagente di compensazione non solo riduce il tempo del protocollo, ma aumenta anche la trasparenza dei tessuti19,24,43,44. Pertanto, la cannulation dell'aorta addominale o dell'arteria renale con successiva perfusione del rene con soluzioni di disidratazione e di corrispondenza dell'indice di rifrazione deve essere considerata per ottenere una pulizia dei tessuti migliore e più veloce. Tuttavia, non abbiamo perfuso l'intero rene con reagenti di compensazione e usato reni tagliati per diversi motivi. In primo luogo, diversi antigeni possono essere visualizzati mediante l'etichettatura anticorpale di più fette di rene da un rene. In secondo luogo, sono necessari meno tempo e anticorpi per eseguire l'immunoetichettatura di una fetta renale rispetto a un rene intero. In terzo luogo, l'imaging 3D di campioni di grandi dimensioni genera set di dati fino a diversi terabyte, il che può essere difficile da gestire per la maggior parte delle workstation. Pertanto, i dati da fette di tessuto o sottoinsiemi di file più grandi sono più convenienti per eseguire operazioni complesse come il conteggio automatico o misurazioni della distanza.
In questo protocollo, la microscopia confocale viene utilizzata per eseguire l'imaging con risoluzione a cella singola, che è particolarmente rilevante negli studi di colocalizzazione. Tuttavia, l'imaging confocale richiede la scansione laser, poiché la sua velocità di imaging è pratica solo per piccoli pezzi di tessuto sgomberato. Per eseguire l'analisi morfometrica 3D di strutture multicellulari come lunghi segmenti di tubuli o persino organi interi, sono necessarie tecniche al microscopio più veloci come i microscopi fluorescenti a foglio di luce (LSFM). LSFM consente l'imaging veloce quando la risoluzione cellulare più alta non è essenziale. Ad esempio, le lunghezze dei tubuli contorto distale sono state recentemente valutate combinando l'etichettatura immunoetichettatura a cavalcatura intera, la compensazione ottica basata su CLARITY12e LSFM29. Sfortunatamente, l'LSFM commerciale è costoso e non sempre compatibile con i protocolli di compensazione basati su solventi. Infatti, CLARITY è stato scelto per questo studio, dal momento che il nostro particolare LSFM con un obiettivo personalizzato per CLARITY non era compatibile con ECi29. Tuttavia, Klingberg e altri hanno dimostrato che l'ECi è in linea di principio compatibile con LSFM14.
In conclusione, viene dimostrato un semplice metodo di compensazione ottica basato su ECi, che può essere applicato a qualsiasi progetto di ricerca utilizzando fette di tessuto fisso che vanno da 100 a diversi millimetri di spessore. Consente inoltre analisi realizzabili che in precedenza richiedevano sforzi quasi esaustivi per completare, ed elimina le ipotesi e le deduzioni richieste associate all'analisi bidimensionale della morfologia. La combinazione di immunoetichettatura a monte intero, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata aiuterà a far progredire la comprensione della funzione cellulare in salute e malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
T. S. è sostenuto da sovvenzioni della DFG German Research Foundation (332853055), else Kraner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) e della Facoltà di Medicina del RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. è supportato da borse di ricerca da Deutsche Gesellschaft pellicco Nephrologie, la Alexander von Humboldt Foundation, e il National Health and Medical Research Council dell'Australia. D. H. E è supportato da Fondation LeDucq. R. K. è supportato da sovvenzioni del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), dello Stato di Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) e del Centro interdisciplinare di ricerca clinica presso la RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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