Summary
De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.
Abstract
Optische clearing technieken maken weefsel doorzichtig door de brekingsindex in een steekproef te equilibreren voor daaropvolgende driedimensionale (3-D) beeldvorming. Ze hebben veel aandacht gekregen in alle onderzoeksgebieden voor het potentieel om microscopische multicellulaire structuren te analyseren die zich uitstrekken over macroscopische afstanden. Gezien het feit dat nierbuisjes, vasculatuur, zenuwen en glomeruli zich in vele richtingen uitstrekken, die tot nu toe slechts gedeeltelijk zijn gevangen door traditionele tweedimensionale technieken, opende weefsel clearing ook veel nieuwe gebieden van nieronderzoek. De lijst van optische clearing methoden groeit snel, maar het blijft moeilijk voor beginners op dit gebied om de beste methode voor een bepaalde onderzoeksvraag te kiezen. Voorzien hier is een eenvoudige methode die antilichamen labelen van dikke muis nierschijfjes combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en kant-en-klare chemisch ethyl CINNAMAAT; en confocale beeldvorming. Dit protocol beschrijft hoe de nieren te parfuseren en een antigeen-ophaal stap te gebruiken om antilichaam binding te verhogen zonder gespecialiseerde apparatuur te vereisen. De toepassing wordt gepresenteerd in beeldvorming verschillende multicellulaire structuren binnen de nier, en hoe u problemen met slechte antilichamen penetratie in weefsel wordt aangepakt. We bespreken ook de potentiële moeilijkheden van het beeldvormende endogene fluor en het verwerven van zeer grote monsters en hoe ze te overwinnen. Dit eenvoudige protocol biedt een eenvoudig te installeren en uitgebreid hulpmiddel om weefsel in drie dimensies te bestuderen.
Introduction
De groeiende belangstelling voor het bestuderen van hele organen of grote multicellulaire structuren hebben geleid tot de ontwikkeling van optische clearing methoden die betrekking hebben op Imaging van transparante weefsel in drie dimensies. Tot voor kort waren de beste methoden om het aantal cellen, de lengte of het volume van hele structuren te schatten stereologie of uitputtende seriële snede, die is gebaseerd op de systemische bemonstering van weefsel voor latere analyse in twee dimensies1, 2 , 3. deze methoden zijn echter tijdrovend en hebben behoefte aan een hoog niveau van opleiding en expertise4. Optische clearing methoden overwinnen deze problemen door het evenwicht van de brekingsindex in een monster te maken van weefsel doorschijnend voor 3D-beeldvorming5,6,7.
Er zijn verschillende optische clearing methoden ontwikkeld die in twee hoofdcategorieën vallen: op oplosmiddel gebaseerde en waterige methoden. Waterige methoden kunnen verder worden onderverdeeld in eenvoudige onderdompeling van8,9, hyperhydratatie10,11, en hydrogel insluiten12,13. Oplosmiddel gebaseerde methoden dehydraat het weefsel, verwijderen lipiden en normaliseren de brekingsindex tot een waarde rond 1,55. Beperkingen van de meeste op oplosmiddelen gebaseerde methoden zijn het afschrikken van endogene fluorescentie van veelgebruikte reporter eiwitten zoals GFP, oplosmiddel toxiciteit, capaciteit om lijm op te lossen die wordt gebruikt in sommige beeldvormings kamers of objectieve lenzen, en krimp van weefsel tijdens Dehydratie14,15,16,17,18,19,20,21. Oplosmiddel gebaseerde methoden zijn echter eenvoudig, tijdbesparend en kunnen in een aantal verschillende weefsel typen werken.
Waterige methoden zijn afhankelijk van de onderdompeling van het weefsel in waterige oplossingen die brekingsindices hebben in het bereik van 1,38-1.528,11,12,22,23,24 . Deze methoden werden ontwikkeld om endogene fluorescerende reporter eiwit emissie te behouden en uitdroging veroorzaakte krimp te voorkomen, maar beperkingen van de meeste waterige gebaseerde clearing methoden omvatten een langere duur van het Protocol, weefsel uitbreiding, en eiwit modificatie (d.w.z. partiële denaturatie van eiwitten door ureum in hyperhydrerende protocollen zoals SCALea2)7,11,23,25. SCALeS gericht weefsel uitbreiding door het combineren van ureum met sorbitol, die tegenwicht door uitdroging van de ureum-geïnduceerde weefsel expansie, en behouden van de weefsel ultrastructuur zoals geëvalueerd door elektronenmicroscopie10. Weefsel krimp of-expansie beïnvloedt de absolute afmetingen van structuren, afstanden tussen objecten of celdichtheid per volume; Zo kan de meting van de grootte veranderingen bij het opruimen van het weefsel helpen bij het interpreteren van de verkregen resultaten7,26.
In het algemeen bestaat een protocol voor optische clearing uit meerdere stappen, waaronder voor behandeling, permeisatie, immunolabeling (indien nodig), brekingsindex matching en beeldvorming met geavanceerde Lichtmicroscopie (bijv. twee-foon, confocale of fluorescentiemicroscopie van licht blad). De meeste van de clearing benaderingen zijn ontwikkeld om neuronale weefsel te visualiseren, en opkomende studies hebben hun toepassing in andere organen5gevalideerd. Deze uitgebreide tool is eerder aangetoond dat het mogelijk maakt betrouwbare en efficiënte analyse van nierstructuren, met inbegrip van glomeruli27,28, immuun infiltraten28, therapieën28, en tubulus segmenten 29, en het is een ideale benadering om beter begrip van glomerulaire functie en tubulus remodellering in gezondheid en ziekte.
Samengevat hier is een oplosmiddel gebaseerde methode die immunokleuring van niertubuli combineert; optische clearing met goedkope, niet-toxisch en gebruiksklaar chemisch ethyl CINNAMAAT (EBI); en confocale microscopie beeldvorming die volledige tubulus visualisatie en kwantificering mogelijk maakt. Deze methode is eenvoudig, combineert antigeen-opvraging van nierschijfjes met kleuring van commerciële antilichamen, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor het toegankelijk is voor de meeste laboratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle hier beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Oregon Health and Science University, Portland, Oregon, VS, en relevante lokale autoriteiten in Aken, Duitsland.
1. Retrograde abdominale aorta perfusie en fixatie van muis nieren
- Bereid oplossingen op dezelfde dag of avond voor en bewaar in een koelkast 's nachts. Warme oplossingen voor het gebruik van kamertemperatuur (RT).
-
Maak een nieuwe batch van 3% Paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Ongeveer 50-100 mL PFA is nodig per muis.
- Om 1 L van 3% PFA te maken: Weeg 30 g PFA af en voeg 800 mL gedistilleerd water toe aan de damp afzuigkap. Roer en verwarm tot 50-60 °C. Niet verwarmen boven 70 °C.
Let op: PFA is giftig. Bereid PFA voor in de dampkap. - Voeg langzaam enkele druppels 2N NaOH toe. Wacht een paar minuten tot PFA in de oplossing gaat of voeg nog een paar druppels toe. Sommige kleine stukjes zullen niet ontbinden.
- Verwijder de oplossing uit de hitte. Voeg 50 mL 20x PBS toe. Chill op ijs naar RT.
- Stel de pH in op 7,3-7.4 met HCl. Voeg gedistilleerd water toe aan 1 L.
- Verwijder alle niet opgeloste deeltjes door het filteren van 1x PBS en 3% PFA met 0,22 μm filter.
- Om 1 L van 3% PFA te maken: Weeg 30 g PFA af en voeg 800 mL gedistilleerd water toe aan de damp afzuigkap. Roer en verwarm tot 50-60 °C. Niet verwarmen boven 70 °C.
- Voeg 1.000 eenheden heparin toe aan 1 L 1x PBS. Breng 1x PBS met heparine en 3% PFA in 1x PBS over in afzonderlijke 50 mL plastic spuiten.
Opmerking: Indien beschikbaar, kan drukgestuurde pomp ingesteld op 80-100 mmHg of hydrostatische druk (druppel methode, de hoogte van de Perfusie oplossingen: 160-200 cm boven het dier) worden gebruikt voor nierperfusie. - Verbind de PBS, PFA en een afgerond zijn 21 G vlindernaald op een drie-weg stopcock. Zorg ervoor dat er geen luchtbelletjes in het hele systeem zitten.
- Label een conische buis van 15 mL en verdeel er 10 mL PFA in.
- Diep anesthetiseren een mannelijk of vrouwelijk C57BL/6 muis 12-24 weken oud met behulp van 120 mg/kg lichaamsgewicht ketamine en 16 mg/kg lichaamsgewicht xylazine. Het dier moet gecontroleerd worden op volledige afwezigheid van responsiviteit door de reflexen te knijpen voordat het doorgaat naar een operatie (bijv. teen pinch reflex).
- Zodra het dier een chirurgische vlak van anesthesie heeft bereikt, zet het op zijn rug onder de ontleed Microscoop. Open de buik chirurgisch met een middenlijn abdominale incisie met behulp van een operatie schaar en bloot de abdominale aorta.
- Klem de abdominale aorta recht boven het vertakken naar de darm slagader met een gebogen hemostat. Vervolgens klem de abdominale aorta direct onder de nierslagaders met een micro serverfijnen. Maak een kleine incisie (1 mm) op de abdominale aorta tussen de twee klemmen met vannas schaar. Steek de vlindernaald langzaam in de incisie en wees voorzichtig om de abdominale aorta open niet te scheuren.
- Ligate de juiste Nierslagader met een 5-0 zijde hecht en verwijder de rechter nier voor andere analyse als slechts één nier nodig is voor perfusie en fixatie.
- Verwijder de micro serverfijnen, transect de portaal ader met vannas-schaar, en parfumeer onmiddellijk met 50 mL PBS die heparin bevat, dan overschakelen en parfuseren met 50 mL 3% PFA.
Opmerking: Hoge perfusiedruk door abdominale aorta is vereist om niertubuli te openen voor betere antilichaam diffusie via weefsel. Perfusie door het hart mag geen niertubuli openen. - Verzamel de geperfundeerd nier zorgvuldig en Vermijd perforeren of knijpen van het weefsel.
- Verwijder de capsule en snijd de nier in 1 mm dikke coronale plakjes. Gebruik een slicermatrix (tabel met materialen) om de segment dikte te standaardiseren.
Opmerking: U ook een vibratome gebruiken. - Dompel de nierschijfjes onder in de geprepareerde PFA in het gelabelde 15 mL conische buisje.
- Breng 10 mL PFA aan op een ander label van 15 mL conische buis. Spoel de drie-weg kraantje en vlindernaald met PBS voordat u naar de volgende muis gaat.
- Voer de post-fixatie 's nachts op RT beschermd tegen licht uit.
2. weefsel voorbereiding en-immunokleuring
- Na de fixatie de nierslice tweemaal wassen met 1x wasbuffer (tafel van de materialen) voor 1 uur op een horizontale Rocker op rt.
- Antigeen-opvraging uitvoeren. Verwarm 300 mL 1x antigeen ontmaskerings oplossing (T instaat van materialen) in een bekerglas van 500 mL tot 92-98 °c. Plaats het segment in de insluitings cassette die doorverbonden is met de verwarmde buffer met roeren gedurende 1 uur bij 92-98 °C. Haal het bekerglas uit de hitte en laat het afkoelen tot RT.
Opmerking: Sommige leveranciers testen hun antilichamen voor immunohistochemie toepassing en zullen een voorgestelde antigeen-Ophaalmethode in het gegevensblad opnemen. Daarom kan voor sommige epitopen een meer basale buffer nodig zijn (bijv. pH 9). - Breng het segment over in 10 mL 1x wasbuffer met 0,1% Triton X-100 en Rock 's nachts op RT. was de sneetjes 2x met 10 mL verse 1x wasbuffer voor 1 uur de volgende dag.
- Verdun het primaire antilichaam in 500 μL van normaal antilichaam verdunningsmiddel (tabel met materialen). Begin met een concentratie van 1:50-1:100. Draai de nierslice voorzichtig in verdund primair antilichaam voor 4 d bij 37 °C.
Opmerking: Aangezien elk antilichaam unieke eigenschappen heeft, moet de temperatuur tijdens antilichaamincubatie en verdunningen van antilichamen worden geoptimaliseerd voor individuele sondes. Voor secundaire antilichamen, incuberen nierweefsel in verdunningsmiddel zonder primair antilichaam. In plaats van commercieel antilichaam verdunent, kan 1x PBS met 0,1% Triton X-100 en 0,01% natrium natriumazide worden gebruikt. - Was de nierslice in 10 mL 1x reinigings buffer 's nachts op RT met één verandering van de wasbuffer na 8 uur.
- Verdun de secundaire antilichamen (bijv. 1:100 voor Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen) in 500 μL van normaal antilichaam verdunningsmiddel. Incuberen de nierschijfjes in verdund secundair antilichaam gedurende 4 dagen bij 37 °C. Vanaf deze stap beschermt u de nierplakjes tegen licht.
- Was de nierschijfjes in 10 mL 1x wasbuffer 's nachts op RT met één verandering van de wasbuffer na 8 uur.
3. weefsel clearing
- Transfer nier Slice naar 5 mL hoogwaardige 100% ethanol (tabel van de materialen) voor 2 h op RT met zachte schommelen (met een verandering in verse ethanol na 1 h). Deze stap is voor weefsel uitdroging.
Opmerking: Hoge kwaliteit ethanol is nodig om een hoge weefsel translucentie in de volgende stap te bereiken. Methanol of tetrahydrofuraan zijn alternatieve dehydratie reagentia met een hoog delipidatie potentiaal. - Dompel het niersegment onder in 2 mL ECi (tabel met materialen) met zachte schommelen bij RT (met een verandering in Fresh ECI na 2 uur) 's nachts.
Opmerking: Het Vries-/smelt punt van ECi is 6-8 °C. Bewaar de monsters daarom niet in de koelkast. Dompel je onder in een goed geventileerde rook afzuigkap en Vermijd direct contact met kleding en huid (ECi is een niet-toxisch voedsel-en geneesmiddelen administratie-goedgekeurde compound maar heeft een sterke geur). Gebruik reguliere Eppendorf-tubes of glazen vaten (geen polystyreen vaten). - Weefsel translucentie kan worden bereikt na een EBI-onderdompeling en wanneer de nierschijfjes klaar zijn voorbeeld vorming.
4. ConfocalImaging en beeldanalyse
Opmerking: Voorbeeld vorming kunnen andere microscopie technieken worden gebruikt, zolang de refractieve index matching-oplossing compatibel is met de objectief lens. Dit protocol maakt gebruik van een omgekeerde confocale Microscoop.
- Voeg 600-1000 μL ECi toe aan de glazen bodem schotel (tabel met materialen).
Opmerking: Vermijd het gebruik van reguliere celkweek gerechten, want ECi is een organisch oplosmiddel dat de plastic gerechten oplost. Evenzo zou ECi plastic onderdelen/isolatie ringen op objectieve lenzen kunnen aanvallen. Raadpleeg de juiste rapporten voor een overzicht van compatibele beeldvormings schalen30 en zelfgemaakte 3-D bedrukte kamers28. - Breng de doorschijnende nierslice in de schaal. Plaats een ronde afdekplaat op de nierslice om licht druk toe te passen op de glazen bodem. Verzegel de schaal met paraffine folie (tabel met materialen) om lekkage van ECI te voorkomen.
Opmerking: Hele organen of meerdere millimeter dikke weefsel sneden kunnen een rand vereisen (tand cement of siliconen elastomeer; Zie tabel met materialen) rond het weefsel om een EBI-pool voor het monster te maken. - Plaats het schaaltje op het Microscoop beeldvormings platform.
- Neem verschillende z-stacks en voer stiksels uit. Begin met een z-Step grootte van 5 μm.
Opmerking: Overweeg het gebruik van lange werkafstand (> 5 mm) en hoge numerieke diafragma (> 0.9) doelstellingen voorbeeld vorming van zeer dikke weefsel plakjes of organen. Na het beeld, breng het weefsel terug naar ethanol en bewaar in de wasbuffer of PBS met 0,02% natrium azide. - Analyseer de afbeelding met 3D-rendering met software (tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nieren zijn complexe organen bestaat uit 43 verschillende celtypen31. De meeste van deze cellen vormen grote multicellulaire structuren zoals glomeruli en tubuli, en hun functie is sterk afhankelijk van interacties met elkaar. Klassieke 2-D histologische technieken vangen deze grote structuren gedeeltelijk op en kunnen de focale veranderingen binnen intacte structuren missen31. Dus, 3D-analyse met behulp van optische clearing technieken helpt om te begrijpen hoe ze functioneren in gezondheid en ziekte.
De meeste optische clearing technieken op basis van oplosmiddelen zullen ten minste gedeeltelijk de endogene fluorescerende reporter eiwit signaal uitdoven. Het bluchen van de YFP-Tagged Parvalbumine werd waargenomen bij uitdroging en optische clearing met ECi (Figuur 1). Andere sterke fluorescerende eiwitten kunnen echter de signaal demping weerstaan en de pH-instelling op basisniveau (pH 8-11) kan de endogene fluorescentie eiwitten van14,20,28,30stabiliseren. Bovendien moeten op water gebaseerde methoden worden overwogen als het behoud van de fluorescentie eiwit emissie gewenst is. In dit huidige verslag wordt aangetoond dat dit op oplosmiddel gebaseerde clearing protocol verenigbaar is met de etikettering van antilichamen; Hoewel, het blijft uitdagend om te bereiken van diepe immunolabeling van weefsel, vooral in een dichte cel-rijk orgaan zoals de nier.
Retrograde abdominale aorta perfusie van de nieren werd vervolgens uitgevoerd om bloedcellen te verwijderen en tubuli te openen (Figuur 2A, B). Deze aanpak verlaagt de auto fluorescentie en verbetert de antilichaam diffusie. De concentratie van het antilichaam hangt af van de grootte van het weefsel en de abundantie van het antigeen. Daarom kan het oppervlakkige signaal betrekking hebben op ofwel slechte penetratie van antilichamen of onvoldoende hoeveelheid antilichaam (Figuur 3A, B, Zie ook film 1). Voor grote monsters of zeer overvloedige markers kunnen hogere concentraties antilichamen en de aanvulling van antilichamen na 1-2 dagen nodig zijn. Als het antigeen van belang wordt uitgedrukt in niervasculatuur, moet intravasculaire afgifte van het antilichaam worden overwogen (figuur 3c). Echter, antilichamen gericht op eiwitten in het apicale membraan van tubulus epitheelcellen niet kruisen de glomerulaire filtratie barrière als gevolg van moleculaire grootte, waardoor onspecifieke signalen in de bloedvaten en glomeruli (figuur 3D).
Dit protocol kan worden toegepast op nierschijfjes of hele nieren (Figuur 4A, B). Om de specificiteit van het antilichaam te testen, werden alleen controles onderworpen aan secundair antilichaam (figuur 4c). Het weefsel kan worden gelabeld met antilichamen om een specifieke celpopulatie te detecteren (bijv. prolifererende cellen, figuur 4D) of om hele tubulensegmenten te visualiseren met behulp van segment-specifieke antilichamen (figuur 4e). Bovendien biedt de combinatie van meervoudige antilichamen de mogelijkheid om verschillende eiwitten in 3-D te colokaliseren (bijv. om segment-specifieke tubulus hyperplasie te detecteren zoals het voorkomt bij het verbouwen van de tubulus op verschillende stimuli) (Figuur 4F, g; Zie ook film 2).
Figuur 1: afschrikken van endogene fluorescerende reporter eiwit signaal. A) de endogene fluorescerende reporter proteïne afgeleid van Parvalbuminyfp +transgene muis is detecteerbaar in 5 μm dunne PFA-vaste bevroren niergedeelten. De pijlen markeren sommige fluorescerende-gelabelde parvalbumin+ cellen gelegen in het vroege deel van de distale gekronelde tubulus. B) geen duidelijk fluorescerende signaal na de optische clearing van nierweefsel wordt waargenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: evaluatie van de kwaliteit van de nierperfusie. (A) periodieke zuur Schiff (pas)-gekleurd paraffine ingebed weefsel (5 μm dunne delen) vertoont weinig buisjes met een licht geopend lumen (meestal proximale tubuli die een borstel rand bezitten; Zie pijlen). B) alle tubuli worden geopend na een goede nierperfusie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: problemen oplossen met whole-Mount immunolabeling. (a,B) Een dikke nierslice werd gekleurd met een antilichaam tegen natriumchloride cotransporter-2 (NKCC2), dat wordt uitgedrukt in het dikke oplopende ledemaat van de lus van Henle. Het signaal is detecteerbaar aan het oppervlak van het weefsel (pijlen in (B)). Echter, het antilichaam niet doordringen in het weefsel [Zie pijlpunt in (B)]. C) intravasculaire antilichaam injectie gericht op eiwitten, uitgedrukt in de vaten (BIJV. CD31), maakt snelle en homogene bloedvat kleuring mogelijk. De ronde structuren met een sterk signaal zijn glomeruli. D) echter, antilichamen gericht op eiwitten, uitgedrukt in het apicale membraan van de tubulus epithei (bijv. fosforylated natriumchloride cotransporter (fosho-NCC), die in de distale ingewikkelde tubulus wordt uitgedrukt), zullen de glomerulaire filtratie barrière, waardoor onspecifieke signalen in de vasculatuur (Zie pijlpunt gericht op afferente arteriolen en andere vaten) en glomeruli (Zie pijlen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve resultaten van immunolabeled optisch geklaard nierweefsel. (a,B) Dit protocol maakt optische clearing van de hele nier mogelijk. C) een representatieve z-stapel om aan te tonen dat er geen sprake is van een niet-specifieke binding van secundair antilichaam als controle zonder voorafgaande incubatie. D) 3D-visualisatie van een representatieve z-stack toont prolifererende bromodeoxyuridine (Brdu)+ cellen in de nier Medulla. E) de medullaire Verzamel kanalen worden gevisualiseerd met behulp van een antilichaam tegen aquaporin-2 (AQP2). (F,G) Analyse en kwantificering van BrdU+ cellen binnen AQP2+ medullaire Verzamel kanalen. Voor (F, G), zie ook film 2. Dit cijfer is gewijzigd van Saritas et al.29. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1 (verwant aan Figuur 3): 3D-visualisatie van NKCC2+dik oplopend ledemaat van de lus van Henle. De film toont een slechte penetratie van antilichamen in een optisch geklaard niersegment. Klik hier om de video te downloaden.
Film 2 (verwant aan Figuur 4): 3D-visualisatie van Brdu+-cellen en AQP2+medullaire Verzamel kanalen in een optisch geklaseerd niersegment. BrdU+ cellen (in rood) en AQP2+ medullaire Verzamel kanalen (in het groen) worden weergegeven. Imaris spot en oppervlak algoritmen werden gebruikt om te bepalen BrdU+ cellen buiten (Turquoise vlekken) of binnen (roze vlekken) AQP2+tubuli (groene oppervlakken). Deze film verscheen oorspronkelijk in Saritas et al. 29. Klik hier om de video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optische clearing technieken hebben brede aandacht gekregen voor 3D-visualisatie en kwantificering van micro anatomie in verschillende organen. Hier werd solvent gebaseerde clearing Method (ECi) gecombineerd met immunolabeling voor 3D-beeldvorming van hele tubuli in nierschijfjes. Deze methode is eenvoudig, goedkoop en snel. Andere onderzoeksvragen kunnen echter het best worden beantwoord met andere clearing protocols5. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat op oplosmiddel gebaseerde methoden weefsel krimp veroorzaken met variabele graden, voornamelijk als gevolg van de uitdroging stap14,18. De meeste op oplosmiddelen gebaseerde methoden (bijv. ECI14) ook ten minste gedeeltelijk de endogene fluorescentie van verslaggevers zoals GFP of tdtomato; dus FDISCO32, CLARITY12, of Cubic11 kan dienen als alternatieve protocollen. Echter, het afschrikken effect van ECi is variabel en is afhankelijk van individuele constructies van elke reporter muis28. Bovendien, gebruik van 1) een fluorescerende antilichaam tegen GFP en andere verslaggevers of 2) gemodificeerde oplosmiddel gebaseerde protocollen die endogene fluorescentie signalen30behouden,32 kan ook een alternatieve aanpak in deze context. Het is vermeldenswaard dat verschillende groepen de compatibiliteit van op water gebaseerde protocollen24,33,34 hebben getest om RNA in 3D te visualiseren, terwijl op oplosmiddel gebaseerde clearing methoden nog niet zijn getest. Daarom moet op waterige gebaseerde clearing methoden zoals de gewijzigde versie van CLARITY33 de voorkeur krijgen wanneer RNA-analyse wordt overwogen.
Cellen of genproducten van belang kunnen worden gevisualiseerd met behulp van transgene muizen met endogene fluorescerende eiwit expressie, maar de generatie van genetisch gemanipuleerde muis lijnen is tijdrovend en duur. Daarom is het labelen van antilichamen praktischer en biedt het meer flexibiliteit, hoewel de immunolabeling van groot weefsel uitdagend is. In tegenstelling tot het oorspronkelijke EBI-protocol14, combineert onze aanpak een gemodificeerde ECI-optische clearing-methode en immunolabeling, die een antigeen-ophaal stap gebruikt. Warmte-geïnduceerde antigeen-opvraging zal eiwitten denatureren, maar helpt om verlies van antigeniciteit te herstellen tijdens PFA-fixatie35 en verbetert de antilichaam binding.
Er zijn enkele kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste is het belangrijk om een goede perfusie van de nier uit te voeren. Hemoglobine met rode bloedcellen beperkt de Imaging diepte7 en uitgebreide tubuli met open lumen verbeteren antilichaam penetratie. De opening van buisjes maakt het ook mogelijk om eiwitten, uitgedrukt in het epitheel apicale membraan, beter te onderscheiden van andere apisch uitgedrukte eiwitten op de contralaterale kant. Kunstmatig geëxpandeerde buisjes kunnen echter een negatieve invloed hebben op de tubulusstructuur en de specifieke pathofysiologische respons van de nier (bijv. verwijding van gewonde proximale tubuli), maar niet van gezonde buisjes36. Ten tweede verbetert de antilichaamincubatie bij 37 °C in plaats van 4 °C of RT de antilichaam penetratie27. Elk antilichaam heeft echter unieke eigenschappen; Zo moet de temperatuur tijdens antilichaamincubatie worden geoptimaliseerd voor individuele sondes. Ten derde helpt het gebruik van Alexa Fluor-647 (far-Red spectrum) secundaire antilichamen de signaal-ruis verhouding te verhogen, vooral omdat de nieren een grote hoeveelheid autofluorescentie uitzenden in het blauw-groene spectrum37.
Retro-orbitale injectie14 of perfusie van nier38 met fluorophore-geconjugeerde antilichamen tegen eiwitten uitgedrukt in bloedvaten is een elegante en snelle manier om niervasculatuur te labelen. Echter, eiwitten in het apicale membraan van tubuli blijven ontoegankelijk door intravasculaire injectie, omdat antilichamen de glomerulaire filtratie barrière niet kunnen passeren met zijn cut-off moleculair gewicht voor filtratie van eiwitten in het bereik van 60-65 kDa. Daarom kan het gebruik van kleine antilichamen fragmenten en samengestelde varianten zoals Fab fragmenten (~ 55 kDa), diabodies (~ 50 kDa), tandem scFv (~ 28 kDa) of nucleïnezuur aptamers (~ 6-30 kDa) met bewaarde moleculaire herkennings eigenschappen van antilichamen een mogelijkheid om toegang te krijgen tot het apicale membraan van tubuli38,39. Daarnaast is de combinatie van kleine antilichamen fragmenten met elektrischevelden 40 ofDruk 13 of het gebruik van natriumdodecylsulfaat (SDS) gebaseerde clearing protocollen voor het verwijderen van lipiden24,41,42 kan snelle en efficiënte penetratie van antilichamen van weefsel mogelijk maken.
Verschillende groepen toonden aan dat perfusie met clearing reagens niet alleen de protocol tijd verkort, maar ook de transparantie van het weefsel verhoogt19,24,43,44. Daarom moet de cannulatie van de abdominale aorta of de nierslagader met daaropvolgende perfusie van de nier met dehydrerende en brekingsindex matching oplossingen worden overwogen om betere en snellere weefsel clearing te bereiken. Echter, we hebben niet parfuseren de hele nier met clearing reagentia en gebruikte gesneden nieren om verschillende redenen. Ten eerste kunnen verschillende antigenen worden gevisualiseerd door antilichamen labelen van meerdere nierschijfjes van één nier. Ten tweede zijn er minder tijd en antilichamen nodig om immunolabeling van een niersegment uit te voeren in vergelijking met een hele nier. Derde, 3D-beeldvorming van grote monsters genereert gegevenssets tot meerdere terabytes, die kan lastig zijn om te beheren voor de meeste werkstations. Daarom zijn gegevens uit weefsel segmenten of subsets van grotere bestanden handiger om complexe bewerkingen uit te voeren, zoals geautomatiseerde tellings-of afstandsmetingen.
In dit protocol wordt confocale microscopie gebruikt om beeldvorming uit te voeren met een resolutie van één cel, wat vooral relevant is in colokalisatie studies. Confocale beeldvorming vereist echter laserscannen, omdat de beeldvormings snelheid alleen praktisch is voor kleine stukjes geclearde weefsels. Om 3-D Morfometrische analyse van multicellulaire structuren zoals lange tubulus segmenten of zelfs hele organen uit te voeren, zijn snellere Microscoop technieken zoals lichtbak fluorescerende microscopen (LSFM) noodzakelijk. LSFM staat snelle beeldvorming toe wanneer de hoogste cellulaire resolutie niet essentieel is. Bijvoorbeeld, de lengtes van distale ingewikkelde tubuli werden onlangs beoordeeld door het combineren van Whole-Mount immunolabeling, optische clearing op basis van duidelijkheid12, en lsfm29. Helaas, commerciële LSFM is duur en niet altijd compatibel met oplosmiddel gebaseerde clearing protocollen. In feite werd voor deze studie duidelijkheid gekozen, aangezien onze specifieke LSFM met een voor de duidelijkheid aangepaste doelstelling niet verenigbaar was met ECi29. Echter, Klingberg et al. toonde aan dat ECi in principe verenigbaar is met LSFM14.
Concluderend, een eenvoudige op ECI gebaseerde optische clearing-methode wordt aangetoond, die kan worden toegepast op elk onderzoeksproject met behulp van vaste weefsel segmenten variërend van ~ 100 μm tot enkele millimeter in dikte. Het laat ook haalbare analyses toe die voorheen bijna uitputtende inspanningen nodig hadden om te voltooien, en elimineert de vereiste veronderstellingen en conclusies in verband met de tweedimensionale analyse van de morfologie. De combinatie van Whole-Mount immunolabeling, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie zal helpen bij het begrijpen van cellulaire functie in gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
T. S. wordt ondersteund door subsidies van de DFG German Research Foundation (332853055), else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), en de medische faculteit van de RWTH Aachen (RWTH returner programma). V. G. P. wordt ondersteund door onderzoeksbeurzen van de Deutsche Gesellschaft fur Nefrologie, de Alexander von Humboldt Foundation en de National Health and Medical Research Council van Australië. D. H. E wordt ondersteund door Fondation LeDucq. R. K. wordt ondersteund door subsidies van de DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), de staat Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) en het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek aan de RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al.
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M.
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
