Summary
Kombinasjonen av antistoff merking, optisk clearing, og avansert lys mikroskopi tillater tredimensjonal analyse av komplette strukturer eller organer. Beskrevet her er en enkel metode for å kombinere immunolabeling av tykke nyre skiver, optisk clearing med etanol Cinnamate, og konfokalmikroskopi Imaging som muliggjør visualisering og kvantifisering av tredimensjonale nyre strukturer.
Abstract
Optiske clearing teknikker gjengi vev gjennomsiktig ved equilibrating brytningsindeksen gjennom en prøve for påfølgende tredimensjonale (3D) Imaging. De har fått stor oppmerksomhet i alle forskningsområder for potensialet til å analysere mikroskopiske flercellede strukturer som strekker seg over makroskopisk avstander. Gitt at nyre tubuli, blodkar, nerver, og glomeruli strekker seg i mange retninger, som bare er delvis tatt til fange av tradisjonelle todimensjonale teknikker så langt, har vevs avregning også åpnet mange nye områder av nyre forskning. Listen over optiske clearing metoder er raskt voksende, men det er fortsatt vanskelig for nybegynnere i dette feltet for å velge den beste metoden for en gitt forskningsspørsmål. Forutsatt her er en enkel metode som kombinerer antistoff merking av tykk mus nyre skiver; optisk clearing med billig, ikke-giftig og klar til bruk kjemiske etanol Cinnamate; og konfokalmikroskopi avbildning. Denne protokollen beskriver hvordan å perfuse nyrer og bruke et antigen-henting trinn for å øke antistoffer-binding uten å kreve spesialisert utstyr. Dens anvendelse er presentert i Imaging forskjellige flercellede strukturer i nyrene, og hvordan du feilsøker dårlig antistoff penetrasjon inn i vevet er adressert. Vi diskuterer også de potensielle vanskelighetene med Imaging endogene fluorophores og anskaffe svært store prøver og hvordan å overvinne dem. Denne enkle protokollen gir en lett-å-setup og omfattende verktøy for å studere vev i tre dimensjoner.
Introduction
Den økende interessen for å studere hele organer eller store flercellede strukturer har ført til utviklingen av optiske clearing metoder som involverer Imaging av transparent vev i tre dimensjoner. Inntil nylig har de beste metodene for å anslå celle nummer, lengde eller volum av hele strukturer vært stereology eller uttømmende seriell snitting, som er basert på systemisk prøvetaking av vev for påfølgende analyse i to dimensjoner1, 2 andre priser , 3. men disse metodene er tidkrevende og trenger et høyt nivå av trening og kompetanse4. Optiske clearing metoder overvinne disse problemene ved å equilibrating brytningsindeksen gjennom en prøve for å gjøre vevet gjennomskinnelig for 3-D Imaging5,6,7.
Flere optiske clearing metoder har blitt utviklet som faller inn i to hovedkategorier: løsemiddelbasert og vandig-baserte metoder. Vandige-baserte metoder kan videre deles inn i enkle nedsenking8,9, hyperhydration10,11, og hydrogel embedding12,13. Løsningsmiddelbasert metoder tørke vevet, fjerner lipider og normaliserer brytningsindeksen til en verdi rundt 1,55. Begrensninger av de fleste løsemiddel-baserte metoder er slukke endogene fluorescens av ofte brukte reporter proteiner som GFP, løsemiddel toksisitet, kapasitet til å oppløse lim brukes i noen tenkelig kamre eller objektiv linser, og krymping av vev under dehydrering14,15,16,17,18,19,20,21. Løsemiddelbasert metoder er imidlertid enkle, tidseffektive og kan fungere i en rekke forskjellige vevstyper.
Vandige-baserte metoder er avhengige av nedsenking av vevet i vandige løsninger som har brytnings indekser i området 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Disse metodene ble utviklet for å bevare endogene fluorescerende reporter protein utslipp og hindre dehydrering-indusert krymping, men begrensningene for de fleste vandige-baserte clearing metoder inkluderer en lengre varighet av protokollen, vev ekspansjon, og protein modifisering (dvs. delvis denaturering av proteiner ved urea i hyperhydrating protokoller som SCALea2)7,11,23,25. SCALeS adressert vev ekspansjon ved å kombinere urea med Sorbitol, som counterbalances ved dehydrering den urea-indusert vev ekspansjon, og bevart vevet Ultrastructure som evaluert av elektron mikroskopi10. Vev krymping eller ekspansjon påvirker absolutte størrelser av strukturer, avstander mellom objekter, eller celle tetthet per volum; Dermed kan måling av størrelsen endringer på clearing av vevet bidra til å tolke de oppnådde resultatene7,26.
Generelt består en protokoll for optisk lysning av flere trinn, inkludert forbehandling, permeabilization, immunolabeling (om nødvendig), brytningsindeks samsvar og bildebehandling med avansert lys mikroskopi (f.eks. to-Foton, konfokalmikroskopi eller lys-ark fluorescens mikroskopi). Mesteparten av clearing tilnærminger har blitt utviklet for å visualisere neuronal vev, og nye studier har validert deres anvendelse i andre organer5. Dette omfattende verktøyet er tidligere demonstrert for å muliggjøre pålitelig og effektiv analyse av nyre strukturer, inkludert glomeruli, immun infiltrerer28, blodkar28og tubule segmenter 29, og det er en ideell tilnærming til bedre forståelse av glomerulær funksjon og tubule remodeling i helse og sykdom.
Oppsummert her er en løsemiddelbasert metode som kombinerer immunostaining av nyre tubuli; optisk clearing med billig, ikke-giftig, og klar til bruk kjemisk etanol Cinnamate (tidlig intervensjon); og konfokalmikroskopi mikroskopi avbildning som gir full tubule visualisering og kvantifisering. Denne metoden er enkel, kombinerer antigen-gjenfinning av nyre skiver med flekker av kommersielle antistoffer, og krever ikke spesialisert utstyr, som gjør det tilgjengelig for de fleste laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet her over var anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av Oregon sunnhet og vitenskap universitet, Portland, Oregon, USA, og relevant innenbys autoritetene inne Aachen, Tyskland.
1. retrograd abdominal aorta og fiksering av mus nyrer
- Forbered løsninger samme dag eller kveld før og oppbevares i kjøleskap over natten. Varme løsninger til romtemperatur (RT) før bruk.
-
Lag en fersk batch med 3% paraformaldehyde (PFA) i 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Om 50-100 mL PFA trengs per mus.
- For å gjøre 1 L av 3% PFA: veie 30 g av PFA og tilsett 800 mL destillert vann i avtrekks panseret. Rør og varme til 50-60 ° c. Ikke varm over 70 ° c.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Klargjør PFA i avtrekks panseret. - Sakte legge til flere dråper 2N NaOH. Vent noen minutter før PFA går inn i løsningen eller legge til noen flere dråper. Noen små biter vil ikke oppløses.
- Fjern oppløsningen fra varmen. Legg 50 mL av 20x PBS. Chill på isen til RT.
- Juster pH til 7.3-7.4 med HCl. Legg destillert vann til 1 L.
- Fjern eventuelle uoppløste partikler ved filtrering 1x PBS og 3% PFA med 0,22 μm filter.
- For å gjøre 1 L av 3% PFA: veie 30 g av PFA og tilsett 800 mL destillert vann i avtrekks panseret. Rør og varme til 50-60 ° c. Ikke varm over 70 ° c.
- Legg 1 000 enheter av heparin til 1 L av 1x PBS. Overfør 1x PBS som inneholder heparin og 3% PFA i 1x PBS i separate 50 mL plast sprøyter.
Merk: Hvis den er tilgjengelig, kan trykk-kontrollerte pumpe sett ved 80-100 mmHg eller hydrostatisk trykk (drypp metoden, høyden på blodtrykks oppløsninger: 160-200 cm over dyr) brukes til nyre blod. - Koble PBS, PFA og en avstumpet 21 G Butterfly nål til en tre-veis stopcock. Kontroller at det ikke er noen luftbobler i hele systemet.
- Merk en 15 mL konisk slange og dispensere 10 mL PFA inn i den.
- Dypt bedøve en mannlig eller kvinnelig C57BL/6-mus 12-24 ukers alder med 120 mg/kg kroppsvekt ketamin og 16 mg/kg kroppsvekt xylazine. Dyret må sjekkes for fullstendig fravær av respons ved å knipe reflekser før du går videre til kirurgi (f. eks, toe klype refleks).
- Når Dyret har nådd et kirurgisk fly av anestesi, plassere den på ryggen under dissekere mikroskop. Kirurgisk åpne magen med en midtlinjen abdominal snitt ved hjelp av en operasjons saks og utsette abdominal aorta.
- Klem abdominal aorta rett over forgrening til iliaca arterien med en buet hemostat. Deretter klemme abdominal aorta rett under nyre arterier med en mikro serrefine. Lag et lite snitt (1 mm) på abdominal aorta mellom de to klemmer med vännäs saks. Sett sommerfugl nålen inn i snittet langsomt og være forsiktig med å rive abdominal aorta åpen.
- Ombinde høyre nyre arterie med en 5-0 silke Sutur og fjerne høyre nyre for annen analyse hvis bare én nyre er nødvendig for blod og fiksering.
- Fjern mikro serrefine, kontinuerlig portalen vene med vännäs saks, og umiddelbart perfuse med 50 mL PBS inneholder heparin, deretter bytte og perfuse med 50 mL av 3% PFA.
Merk: Høyt trykk gjennom abdominal aorta er nødvendig for å åpne nyre tubuli for bedre antistoff diffusjon gjennom vev. Å komme gjennom hjertet kan ikke åpne nyre tubuli. - Samle perfusert nyre nøye og unngå punktering eller klemme vevet.
- Fjern kapselen og skjær nyrene i 1 mm tykke koronale skiver. Du kan bruke en matrise for slicer (tabell med materialer) til å standardisere skjæretykkelse.
Merk: Alternativt kan du vurdere å bruke en vibratome. - Dypp nyre sektorene med den klargjorte PFA i det merkede 15 mL koniske røret.
- Dispensere 10 mL PFA til en annen merket 15 mL konisk slange. Skyll treveis stopcock og Butterfly nålen med PBS før du flytter til neste mus.
- Utfør etter fiksering over natten på RT beskyttet mot lys.
2. vevs forberedelser og Immunostaining
- Etter fiksering, vask nyres tykket to ganger med 1x vaskebuffer (tabell av materialer) for 1 time på en horisontal ROCKER på RT.
- Utfør antigen henting. Varm opp 300 mL 1x antigen avsløre oppløsning (Tstand of Materials) i et 500 ml beger til 92-98 ° c. Sett stykket i innebygging kassett gjennomtrengelig til oppvarmet buffer med omrøring for 1 h ved 92-98 ° c. Fjern begeret fra varmen og la det avkjøles til RT.
Merk: Noen leverandører teste sine antistoffer for immunhistokjemi programmet og vil inkludere en foreslått antigen henting metoden i dataarket. Derfor kan noen epitopes kreve en mer grunnleggende buffer (f.eks. pH 9). - Overfør stykket til 10 mL 1x vaskebuffer med 0,1% Triton X-100 og rock over natten ved RT. vask skivene 2x med 10 mL fersk 1x vaskebuffer for 1 t neste dag.
- Fortynne det primære antistoff i 500 μL av normal antistoff fortynningsmiddel (tabell av materialer). Begynn med en konsentrasjon på 1:50-1:100. Skjær nyre sektoren forsiktig i fortynnet primær antistoff for 4 d ved 37 ° c.
Merk: Siden hvert antistoff har unike egenskaper, må temperaturen under antistoff inkubasjons og fortynninger av antistoff optimaliseres for individuelle sonder. For sekundære antistoff-bare kontroller, ruge nyre vev i fortynningsmiddel uten primære antistoff. I stedet for et kommersielt antistoff fortynningsmiddel kan 1x PBS med 0,1% Triton X-100 og 0,01% natrium Natriumazid brukes. - Vask nyres tykket i 10 mL 1x vaskebuffer over natten på RT med en endring av vaskebuffer etter 8 timer.
- Fortynne sekundære antistoffer (f. eks 1:100 for Alexa fluor-bøyd sekundære antistoffer) i 500 μL av normal antistoff fortynningsmiddel. Ruge nyre sektorene i fortynnet sekundær antistoff i 4 dager ved 37 ° c. Fra dette trinnet og framover, beskytte nyrene skiver fra lys.
- Vask nyre sektorene i 10 mL 1x vaskebuffer over natten på RT med en endring av vaskebuffer etter 8 timer.
3. fjerning av vev
- Overfør nyre sektoren til 5 mL høy klasse 100% etanol (tabell av materialer) for 2 timer ved RT med skånsom rocking (med en endring til fersk etanol etter 1 h). Dette trinnet er for vev dehydrering.
Merk: Høy grad etanol er nødvendig for å oppnå en høy vev gjennomskinnelighet i neste trinn. Metanol eller tetrahydrofuran er alternative dehydrering reagenser med høyt delipidation potensiale. - Dypp nyres tykket i 2 mL tidlig intervensjon (tabell av materialer) med skånsom ROCKING ved RT (med en endring i fersk tidlig intervensjon etter 2 timer) over natten.
Merk: Det iskalde/smeltepunktet for tidlig intervensjon er 6-8 ° c. Du må derfor ikke lagre prøvene i kjøleskapet. Utfør nedsenking i en skikkelig ventilert avtrekks hette og unngå direkte kontakt med klær og hud (tidlig intervensjon er en ikke-giftig Food and Drug Administration-godkjent sammensatt, men har en sterk lukt). Bruk vanlige Eppendorf rør eller glass fartøy (ingen polystyren fartøy). - Vevs gjennomskinnelighet kan oppnås etter nedsenking i førskolealder og når nyre sektorene er klare for bildebehandling.
4. ConfocalImaging og bildeanalyse
Merk: For bildebehandling kan andre mikroskopi teknikker brukes så lenge den samsvarende brytningsindeks løsningen er kompatibel med objektivlinsen. Denne protokollen bruker et invertert konfokalmikroskopi mikroskop.
- Tilsett 600-1000 μL av tidlig intervensjon i glass bunnen (tabell over materialer).
Merk: Unngå bruk av vanlige cellekultur retter, fordi tidlig intervensjon er et organisk løsningsmiddel som vil oppløse plast rettene. På samme måte kan tidlig intervensjon i førskolealder angripe plastdeler/isolasjons ringer på objektiv linser. Se de aktuelle rapportene for en oversikt over kompatible bildebehandlings retter30 og Self-laget 3-D trykte kamre28. - Overfør gjennomskinnelig nyre skive inn i fatet. Plasser en rund dekkglass på nyre stykket for å påføre lett trykk mot glass bunnen. Forsegle parabolen med parafin film (tabell av materialer) for å unngå lekkasje av tidlig intervensjon.
Merk: Hele organer eller flere millimeter-tykke vev skiver kan kreve en grense (Dental sement eller silikon elastomer; se tabell over materialer) rundt vevet for å gjøre et tidlig svømmebasseng for prøven. - Plasser fatet på bilde plattformen i mikroskopet.
- Ta flere z-stabler og utføre søm. Start med en z-trinns størrelse på 5 μm.
Merk: Vurder å bruke lang arbeidsavstand (> 5 mm) og høy numerisk blenderåpning (> 0,9) mål for avbildning av svært tykt vev skiver eller organer. Etter Imaging, overføre vevet tilbake til etanol og lagre i vaskebuffer eller PBS med 0,02% natrium Natriumazid. - Analyser bildet ved hjelp av 3D-gjengivelse med programvare (tabell med materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyrer er komplekse organer består av 43 forskjellige celletyper31. De fleste av disse cellene danner store flercellede strukturer som glomeruli og tubuli, og deres funksjon er svært avhengig av interaksjon med hverandre. Klassiske 2-D histologiske teknikker delvis fange disse store strukturene og kan gå glipp av fokal endringer innenfor intakt strukturer31. Dermed bidrar 3-D-analyse ved hjelp av optiske clearing teknikker for å forstå hvordan de fungerer i helse og sykdom.
De fleste løsningsmiddelbasert optisk clearing teknikker vil minst delvis slukke endogene fluorescerende reporter protein signal. Slukking av YFP-Tagged Parvalbumin ble observert ved dehydrering og optisk lysning med tidlig intervensjon (figur 1). Imidlertid kan andre sterke fluorescerende proteiner motstå signal-slukke, og justering av pH til grunnleggende nivåer (pH 8-11) kan stabilisere endogene fluorescerende proteiner14,20,28,30. I tillegg bør vandig-baserte metoder vurderes hvis fluorescerende protein utslipps bevaring er ønskelig. I denne aktuelle rapporten er det demonstrert at denne løsningsmiddelbasert avregnings protokollen er kompatibel med antistoff merking; Selv om, er det fortsatt utfordrende å oppnå dyp immunolabeling av vev, spesielt i en tett celle-rik organ som nyrene.
Retrograd abdominal aorta av nyrene ble deretter utført for å fjerne blodceller og åpne opp tubuli (figur 2A, B). Denne tilnærmingen minsker autofluorescence og forbedrer antistoff diffusjon. Antistoff konsentrasjon avhenger av størrelsen på vev og overflod av antigen. Derfor kan det overfladiske signalet forholde seg til enten dårlig antistoff inntrengning eller utilstrekkelig mengde antistoff (Figur 3A, B, se også film 1). For store prøver eller svært rikelig markører, kan høyere konsentrasjoner av antistoff og påfyll av antistoff etter 1-2 dager være nødvendig. Hvis antigen av renter er uttrykt i nyre blodkar, bør intravaskulær levering av antistoff vurderes (figur 3c). Antistoffer mot proteiner i den apikale membranen av tubule epitelceller krysser imidlertid ikke glomerulær filtrerings barriere på grunn av molekylær størrelse, noe som forårsaker løs signaler i blodkar og glomeruli (figur 3D).
Denne protokollen kan brukes til nyre skiver eller hele nyrer (Figur 4A, B). For å teste antistoff spesifisitet, ble bare kontroller utsatt for sekundært antistoff (figur 4c). Vevet kan merkes med antistoffer for å oppdage en bestemt cellepopulasjon (f. eks, voksende celler, figur 4d) eller for å visualisere hele tubule segmenter ved hjelp av segment spesifikke antistoffer (figur 4e). Videre gir kombinasjonen av flere antistoffer muligheten til å colocalize forskjellige proteiner i 3-D (f. eks, å oppdage segment-spesifikke tubule, slik det skjer i tubule remodeling på ulike stimuli) (Figur 4F, g; også se film 2).
Figur 1: slukke endogene fluorescerende reporter protein signal. (A) endogene fluorescerende reporter protein avledet fra ParvalbuminYFP +transgene mus er synlig i 5 μm tynne PFA-faste frosne nyre seksjoner. Pilene markerer noen fluorescerende-merket parvalbumin+ celler ligger i den tidlige delen av den opp-tubule. (B) ingen åpenbare fluorescerende signal etter den optiske clearing av nyre vev er observert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: evaluering av kvaliteten på nyre- (A) periodisk acid SCHIFF (Pas)-beiset parafin innebygd vev (5 μm tynne seksjoner) viser noen tubuli med en litt åpnet lumen (vanligvis proksimale tubuli som besitter pensel grensen; se piler). (B) alle tubuli er åpnet etter god nyre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: feilsøking av hel monterings immunolabeling. (A,B) En tykk nyre skive ble beiset med et antistoff mot natrium-klorid cotransporter-2 (NKCC2), som uttrykkes i den tykke stigende lem av loopen av Henles. Signalet er synlig på overflaten av vevet (pilene i (B)). Men antistoff ikke trenge inn i vevet [se pilspissen i (B)]. (C) intravaskulær antistoff injeksjons målretting proteiner uttrykt i fartøyene (f. eks, CD31) tillater rask og homogen blodkar farging. De runde strukturene med et sterkt signal er glomeruli. (D) imidlertid antistoffer rettet mot proteiner uttrykt i apikale membran av tubule prolifererende (f. eks, fosforylert natrium-klorid cotransporter (FOSFAT-NCC) som uttrykkes i den videre convoluted tubule) vil ikke krysse glomerulær filtrerings barriere, og dermed forårsaker løs signaler i blodkar (se Pilspissen peker på afferente arterioler og andre fartøy) og glomeruli (se piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative resultater av immunolabeled optisk ryddet nyre vev. (A,B) Denne protokollen tillater optisk clearing av hele nyrene. (C) en representativ z-stabel for å vise fravær av ikke-spesifikk binding av sekundært antistoff som kontroll uten tidligere inkubasjons. (D) 3-D visualisering av en representant z-stack viser voksende Bromodeoxyuridine (BrdU)+ celler i nyre forlengede. (E) medullær samle kanaler er visualisere ved hjelp av et antistoff mot aquaporin-2 (AQP2). (F,G) Analyse og kvantifisering av BrdU+ celler i AQP2+ medullær samle kanaler. For (F, G), se også film 2. Dette tallet er blitt modifisert fra Saritas et al.29. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1 (relatert til Figur 3): 3-D visualisering av NKCC2+tykk stigende lem av loopen av henles. Filmen demonstrerer dårlig antistoff penetrasjon i en optisk ryddet nyre skive. Vennligst klikk her for å laste ned videoen.
Movie 2 (relatert til Figur 4): 3-D visualisering av BrdU+celler og AQP2+medullær samle kanaler i en optisk ryddet nyre skive. BrdU+ celler (i rødt) og AQP2+ medullær samle kanaler (i grønt) vises. Imaris spot og overflate algoritmer ble brukt til å bestemme BrdU+ celler utenfor (turkis flekker) eller inne (rosa FLEKKER) AQP2+tubuli (grønne overflater). Denne filmen opprinnelig dukket opp i Saritas et al. 29. please Klikk her for å laste ned videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optisk clearing teknikker har fått bred oppmerksomhet for 3-D visualisering og kvantifisering av microanatomy i ulike organer. Løsemiddelbasert avregnings metode (tidlig intervensjon) ble kombinert med immunolabeling for 3-D bildebehandling av hele tubuli i nyre skiver. Denne metoden er enkel, billig og rask. Imidlertid, annet forskning spørsmål kanskje være best besvart med annet oppryddingen protokoller5. Det er også viktig å huske på at løsningsmiddelbasert metoder forårsaker vevs svinn på variable grader, hovedsakelig på grunn av dehydrering trinn14,18. De fleste løsningsmiddelbasert metoder (f. eks, førskolealder14) også minst delvis slukke endogene FLUORESCENS av journalister som GFP eller tdTomato; Dermed kan FDISCO32, Clarity12, eller kubikk11 fungere som alternative protokoller. Den brå virkningen av tidlig intervensjon i førskolealder er imidlertid variabel og avhenger av individuelle konstruksjoner av hver reporter mus28. I tillegg, bruk av 1) et fluorescerende antistoff mot GFP og andre journalister eller 2) modifisert løsningsmiddelbasert protokoller som bevarer endogene fluorescens signaler30,kan32 også være en alternativ tilnærming i denne sammenhengen. Det er verdt å nevne at flere grupper har testet kompatibiliteten til vandige-baserte protokoller24,33,34 for å visualisere RNA i 3-D, mens løsemiddelbasert clearing metoder ennå ikke er testet. Dermed bør vandige-baserte clearing metoder som den modifiserte versjonen av CLARITY33 FORETREKKES når RNA-analysen vurderes.
Celler eller gen produkter av interesse kan bli visualisere ved hjelp av transgene mus med endogene fluorescerende protein uttrykk, men generering av genetisk konstruerte muse linjer er tidkrevende og kostbart. Derfor er antistoff merking mer praktisk og gir mer fleksibilitet, selv om immunolabeling av stort vev er utfordrende. I motsetning til den opprinnelige protokoll14i tidlig intervensjon, kombinerer vår tilnærming en modifisert optisk fjerningsmetode for tidlig intervensjon og immunolabeling, som bruker et trinn i antigen-henting. Varme indusert antigen-gjenfinning vil denaturere proteiner, men bidrar til å gjenopprette tap av antigenisiteten under PFA-fiksering35 og forbedrer antistoff-binding.
Det finnes noen viktige trinn i denne protokollen. For det første er det viktig å utføre god bruk av nyrene. Hemoglobin inneholder røde blodlegemer begrenser Imaging dybde7 og utvidet tubuli med åpen lumen forbedre antistoff penetrasjon. Åpningen av tubuli gir også bedre skille mellom proteiner uttrykt i epitel apikale membran fra andre apically uttrykt proteiner på kontralateral side. Imidlertid kan kunstig utvidet tubuli negativt påvirke tubule struktur og maske spesifikke patofysiologiske respons av nyrene (f. eks utvidelse av skadde proksimale tubuli,) men ikke av sunne tubuli36. For det andre, antistoff inkubasjons ved 37 ° c i stedet for 4 ° c eller RT forbedrer antistoff penetrasjon27. Imidlertid har hvert antistoff unike egenskaper; Dermed må temperaturen under antistoff inkubasjons optimaliseres for individuelle sonder. Tredje, bruk av Alexa fluor-647 (langt-rødt spektrum) sekundære antistoffer bidrar til å øke signal-til-støy-forhold, spesielt siden nyrene avgir en stor mengde autofluorescence i det blå-grønne spekteret37.
Retro-orbital injeksjon14 eller blod av nyre38 med fluoroforen-bøyd antistoffer mot proteiner uttrykt i blodkar er en elegant og rask måte å merke nyre blodkar. Proteiner i apikale membran av tubuli forblir imidlertid utilgjengelige ved intravaskulær injeksjon siden antistoffer ikke kan krysse den glomerulær filtrerings barrieren med sin cut-off molekylvekt for filtrering av proteiner i området 60-65 kDa. Derfor kan bruken av små antistoff fragmenter og konstruerte varianter som Fab-fragmenter (~ 55 kDa), diabodies (~ 50 kDa), tandem scFv (~ 28 kDa) eller nukleinsyre aptamers (~ 6-30 kDa) med bevarte egenskaper for molekylær gjenkjennelse av antistoffer gi en mulighet til å få tilgang til apikale membran av tubuli38,39. I tillegg er kombinasjonen av små antistoff fragmenter med elektriske felt40 eller trykk13 eller bruk av natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS)-baserte clearing protokoller for å fjerne lipider24,41,42 kan muliggjøre rask og effektiv antistoff inntrengning av vev.
Flere grupper viste at å tømme reagens ikke bare reduserer protokollen tid, men også øker vev åpenhet19,24,43,44. Derfor bør kanyleringen av abdominal aorta eller nyre arterien med påfølgende blod av nyrene med dehydrating og brytningsindeks samsvarende løsninger vurderes for å oppnå bedre og raskere vev clearing. Men vi har ikke perfuse hele nyrene med avregning reagenser og brukte skiver nyrer av flere grunner. For det første kan ulike antigener bli visualisere ved antistoff merking av flere nyre skiver fra en nyre. For det andre, mindre tid og antistoff er nødvendig for å utføre immunolabeling av en nyre skive i forhold til en hel nyre. Tredje, 3-D Imaging av store prøver genererer datasett opp til flere terabyte, som kan være utfordrende å håndtere for de fleste arbeidsstasjoner. Derfor er data fra vevs skiver eller delsett av større filer enklere å utføre kompliserte operasjoner som for eksempel automatiserte telle-eller avstandsmålinger.
I denne protokollen brukes konfokalmikroskopi mikroskopi til å utføre avbildning med én celle oppløsning, noe som er spesielt relevant i colocalization studier. Imidlertid, konfokalmikroskopi tenkelig behøver laserskanning, siden dens tenkelig fart er bare praktisk for liten stykker av klarnet tissue. For å utføre 3-D morphometric analyse av flercellede strukturer som lange tubule segmenter eller hele organer, raskere mikroskop teknikker som lys ark fluorescerende mikroskop (LSFM) er nødvendig. LSFM tillater rask bildebehandling når den høyeste cellulære oppløsningen ikke er nødvendig. For eksempel, lengdene av fjerne convoluted tubuli ble nylig vurdert ved å kombinere hel-Mount immunolabeling, optisk clearing basert på CLARITY12, og LSFM29. Beklageligvis, reklamen LSFM er dyr og ikke alltid forenlig med løsemiddel-basert oppryddingen protokoller. Faktisk ble CLARITY valgt for denne studien, siden vår spesielle LSFM med en objektiv tilpasset for CLARITY ikke var forenlig med tidlig intervensjon29. Men Klingberg et al. demonstrerte at tidlig intervensjon er i prinsippet kompatibel med LSFM14.
Som konklusjon, en enkel tidlig intervensjon-basert optisk clearing metoden er demonstrert, som kan brukes til ethvert forskningsprosjekt ved hjelp av faste vev skiver fra ~ 100 μm til flere millimeter i tykkelse. Det tillater også gjennomførbare analyser som tidligere krevde nesten uttømmende innsats for å fullføre, og eliminerer de nødvendige forutsetninger og slutninger knyttet til todimensjonal analyse av morfologi. Kombinasjonen av hel-Mount immunolabeling, optisk clearing, og avansert lys mikroskopi vil hjelpe forhånd forståelsen av cellulære funksjon i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
T. S. støttes av tilskudd fra DFG tyske forskningsstiftelse (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), og det medisinske fakultet i RWTH Aachen (RWTH Returner program). V. G. P. støttes av stipendiat stillinger fra Deutsche Gesellschaft pels Nephrologie, Alexander von Humboldt Foundation, og National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E støttes av Fondation LeDucq. R. K. er støttet av tilskudd fra DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), staten Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) og tverrfaglig senter for klinisk forskning ved RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 G butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| Curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| Dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| Hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| Horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al.
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M.
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
