Summary
Настоящий протокол описывает пошаговые рекомендации по методам эксплуатации РНКи в P. americana.
Abstract
Тараканы, санитарный вредитель, являются важными видами в исследованиях развития насекомых и метаморфических исследований из-за их легкого кормления и гемиметаболических характеристик. В совокупности с хорошо аннотированными последовательностями генома эти преимущества сделали американского таракана, Periplaneta americana, важной моделью гемиметаболических насекомых. Ограниченный нехваткой нокаут-стратегии, эффективный нокдаун генов на основе РНК-интерференции (РНКи) становится незаменимым методом в функциональных генных исследованиях P. americana. Настоящий протокол описывает методы работы РНКи в P. americana. Протокол включает в себя (1) отбор P. americana на соответствующих стадиях развития, (2) подготовку к установке инъекции, (3) инъекцию дцРНК и (4) обнаружение эффективности нокдауна генов. РНКи является мощным обратным генетическим инструментом у P. americana. Большинство тканей P. americana чувствительны к внеклеточной дцРНК. Его простота позволяет исследователям быстро получать дисфункциональные фенотипы под одной или несколькими целевыми инъекциями дцРНК, что позволяет исследователям лучше использовать P. americana для исследований развития и метаморфизма.
Introduction
РНК-интерференция (РНКи), эволюционно сохраненный механизм, постепенно становится важным обратно-генетическим инструментом для ингибирования экспрессии генов во многих организмах1, поскольку Эндрю Файр и Крейг Мелло2 разработали стратегию двухцепочечной РНК (дцРНК), опосредованной генной тишины. дцРНК расщепляется на фрагменты 21-23 нуклеотидов, небольших интерферирующих РНК (siRNAs), ферментом Dicer в клетках для активации пути RNAi. Затем siRNAs включаются в РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC), который соединяется с целевой мРНК, вызывает расщепление мРНК и, наконец, приводит к потере функции гена 3,4,5. Среди видов насекомых до сих пор сообщалось о многих системных экспериментах RNAi во многих отрядах насекомых, таких как Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera и Blattodea 5,6,7,8.
Тараканы (Blattaria) являются важным семейством насекомых в исследованиях развития и метаморфизма с их быстрыми циклами роста, сильной приспособляемостью к окружающей среде и высокой пластичностью развития9. Прежде чем обнаружить, что RNAi совместим с тараканами, предыдущие исследования были сосредоточены только на профилактике и контроле тараканов из-за нехватки методов генетических манипуляций у тараканов. Уникальная структура таракана оотеки усложнила выполнение нокаута гена на основе инъекций эмбрионов с помощью системы CRISPR-Cas9. Кроме того, большинство тканей у тараканов (таких как P. americana) демонстрируют устойчивый системный ответ РНКи, что позволяет быстро генерировать дисфункциональные фенотипы путем инъекции одного или нескольких дцРНК 9,10,11. Эти особенности сделали РНКи незаменимым методом в генных функциональных исследованиях у P. americana.
Несмотря на то, что об использовании РНКи в исследованиях функциональных генов у P. americana сообщалось, подробного или пошагового описания не было. В этом отчете представлено одно пошаговое операционное руководство для RNAi у P. americana, полезное для изучения функции генов у других тараканов. Кроме того, это руководство не ограничивается Blattodea и может быть применено ко многим другим насекомым с незначительными изменениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Линия P. americana была первоначально предоставлена доктором Хуэйлин Хао. Этот вид поддерживается инбридингом в течение 30 лет9.
1. Вылупление и кормление P. americana
- Соберите свежие оотеки (сразу после яйцекладки) P. americana и инкубируйте в темном инкубаторе при 25 °C и влажности 60% в течение ~ 25 дней. Затем увеличьте температуру и влажность до 30 °C и 75% за 3 дня до вылупления.
- Используйте сито с отверстием 4 мм, чтобы отделить заштрихованных нимф от оотеков.
- Храните нимф в цилиндрических контейнерах (12 см в диаметре и 10 см в высоту) в темноте при 28 °C, влажности 70%. Смажьте внутренний край контейнеров вазелином, чтобы предотвратить побег тараканов. Обеспечьте крысиную пищу, воду и укрытие (лотки для яиц). Обращайте внимание на активность нимф и регулярно убирайте кал и мусор.
2. Подбор нимф в правильной звезде
- Используйте стеклянную трубку, чтобы выбрать свежеливую P. americana (белого цвета тела). Храните их в новых емкостях и дождитесь правильного этапа лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Через ~19 дней при вышеуказанных условиях кормления нимфы в3-х звездах будут доступны для инъекций. Цвет свежелифованных тараканов белый, а звездочки проясняются временем линьки.
3. Подготовка целевого фрагмента с промоторами Т7
- Используя кДНК P. americana в качестве шаблона, разработали парные праймеры для выполнения ПЦР для получения фрагмента ДНК 300-800 bp гена-мишени9. Затем клонируйте фрагмент ПЦР в вектор pTOPO (см. Таблицу материалов) для секвенирования.
- Используя целевой фрагмент ДНК в качестве шаблона, синтезируют одну новую пару праймеров с последовательностью промоторов Т7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') на 5' терминалах и выполняют еще один раунд ПЦР для получения целевого фрагмента с промоторами Т7 на каждой стороне9.
4. Транскрипция и синтез дцРНК in vitro
- Добавьте 10 мкл буфера T7 2X, 2 мкл ферментной смеси, T7 Express (см. Таблицу материалов) и 2 мкг продукта ПЦР (полученного на стадии 3.2) в реакционную систему и добавьте общий объем до 20 мкл с ddH2O. Осторожно перемешайте вверх ногами вручную и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин и 70 °C в течение 10 мин, а затем медленно остудить до комнатной температуры.
- Раствор РНКазы А (4 мкг/мкл) с ddH2Oв соотношении 1:200. Затем добавляют в систему 1 мкл RQ1 RNase-Free DNase (1 U/μL) и 1 мкл разбавленного раствора RNase A (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь объем одной системы составляет 22 мкл. - Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин. Затем добавляют 10% от общего объема (при одновременном выполнении N-реакций общий объем составляет N x 22 мкл) ацетата натрия и три объема от общего объема изопропанола.
- Аккуратно перемешать вверх ногами вручную, поместить на лед на 5 мин и центрифугу при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Удалите супернатант пипеткой, промыть остаток 75% этанолом (с 25% диэтилпирокарбонатом (DEPC) очищенной водой), а затем центрифугировать при 13 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Снова удалите супернатант. Высушите гранулы на воздухе в течение 15 мин при комнатной температуре. Используйте ~100 мкл воды DEPC для растворения дцРНК, затем разбавьте дцРНК до конечных 2 мкг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: ДцРНК может храниться при -80 °C в течение 6 месяцев.
5. Загрузка раствора дцРНК в шприц
- Настройте программу в микроинжекционном насосе (см. Таблицу материалов) заранее, чтобы обеспечить согласованность объема каждого впрыска. Перед использованием шприца очистите шприц, заполнив его водой DEPC 8-10 раз.
- Установите шприц объемом 10 мкл на микроинжекционный насос, запустите насос и заполните шприц 10 мкл раствора дцРНК (подготовленного на этапе 4.6). Введите 1 мкл дцРНК в3-ю звездную нимфу (см. шаг 2) и убедитесь, что она не просачивается в организм.
6. Инъекция дцРНК в P. americana
- Обезболивайте тараканов повышенной концентрацией CO2 в контейнере до тех пор, пока тараканы больше не двигаются, а затем немедленно приступайте к инъекции.
- Осторожно подберите таракана пинцетом, и доставьте таракана к игле рукой. Затем введите иглу через зазор между двумя брюшными сомитами горизонтально против эпидермиса. Что касается глубины вставки, чем мельче, тем лучше.
- Затем вводят раствор дцРНК в таракана. Наконец, вытащите кончик иглы. Убедитесь, что кончик иглы находится как можно ближе к эпидермису, чтобы избежать повреждения внутренних органов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция должна быть сделана под рассеченным микроскопом. - Поместите введенных тараканов в чистые контейнеры для биоанализа. Подождите около 10-20 минут, чтобы они оправились от эффектов CO2 . Маркировка контейнеров с указанием даты инъекции, типа и дозы дцРНК, а также возраста P. americana.
- Поместите введенных тараканов в темную среду при температуре 28 °C, влажности 70%, обеспечьте воду, корм и укрытие, а также регулярно наблюдайте за возможными изменениями фенотипа тараканов.
7. Подтверждение нокдауна и фенотипический анализ
- Оцените эффективность РНКи, используя любые доступные методы молекулярной биологии, такие как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и вестерн-блоттинг. Подробные сведения о процедурах qRT-PCR и вестерн-блоттинга см. в ссылках 1,12.
- Для наблюдения и анализа фенотипов, связанных с РНКи, используйте микроскоп, подходящий для живых животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНКи могут влиять на морфологию, поведение, линьку, регенерацию конечностей и другую физиологическую активность тараканов. Удельная частота фенотипа рассчитывается в соответствии с конкретными условиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана успешная инъекция. Микроинъекционный шприц с иглой микродиаметра должен быть горизонтально размещен на бустере (рисунок 1А). Игла вводится через зазор между двумя брюшными сомитами горизонтально против эпидермиса (рисунок 1B). Следите за тем, чтобы жидкость попала в брюшную полость P. americana . Слишком крутой угол иглы повредит внутренние органы (рисунок 1С), а неправильный впрыск приведет к утечке раствора дцРНК из брюшной полости (рисунок 1D). Если какая-либо дцРНК вытекает наружу, животное нужно выбросить, и сделать еще одну инъекцию. P. americana необходимо полностью обезболить во время инъекции.
Как и другие биологические эксперименты, контрольные группы необходимы при проведении лечения РНКи. Различия в лечении должны быть подтверждены, вызванные целевым РНКI, а не из-за нецелевых эффектов дцРНК, повреждения во время инъекции или анестезииCO2 . Здесь гены Ddc (Dopa decarboxylase) и Dpp (декапентаплегические) были выбраны в качестве двух примеров для наблюдения фенотипа линяющих тараканов после инъекции дцРНК, а отрицательный контроль dsMock11 , который не имеет мишени у животных, был выполнен в качестве отрицательного контроля, эффективность РНКи была обнаружена с помощью qRT-PCR (Рисунок 2). Взяв в качестве примера инъекцию dsDdc (рисунок 3A, B), P. americana со сбитым геном Ddc будет иметь белый эпидермис в течение длительного времени, так как меланизация блокируется (рисунок 3B). В эксперименте с инъекциями dsDpp , которые необходимы для регенерации конечностей, РНКи нарушил регенерацию конечностей (рисунок 4), о чем сообщалось ранее9.
Рисунок 1: Инструмент и правильная операция впрыска. (A) Шприц на микроинъекционном инструменте. (B) Правильное положение инъекционной иглы; жидкость не выходит. (C) Слишком крутой угол инъекционной иглы может повредить внутренние органы. (D) Неудачная инъекция приводит к тому, что раствор дцРНК или гемолимфа вытекают наружу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Эффективность РНКи, обнаруженная с помощью qRT-PCR. Эффективность нокдауна генов Ddc и Dpp была обнаружена с помощью qRT-PCR, и dsMock использовался в качестве отрицательного контроля. Для каждого лечения использовались три реплики, а полосы ошибок указывают на стандартное отклонение трех реплик. Значимость различий была проанализирована с помощью t-теста Стьюдента. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примеры успешных РНКИ для нарушения меланизации эпидермиса у P. americana. (А) Нормальный таракан после инъекцииdsMock с нормальной меланизией. (B) Ddc RNAi опосредован альбинистическим P. americana после линьки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры успешных РНКИ для нарушения регенерации конечностей у P. americana. (A) A P. americana с ампутированной задней ножкой.(B-C) P. americana после ЛЕЧЕНИЯ РНКи и линьки. Задняя часть была регенерирована в контрольной группе dsMock (B), но не тогда, когда ген Dpp (C) был заглушен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем докладе описана методологическая пошаговая стратегия РНКи в P. americana; Следует отметить, что его также можно применять к другим тараканам (Blattella germanica, например) и многим другим насекомым с незначительными изменениями. Тем не менее, эффективность глушения генов РНКи не всегда достаточно высока, с очевидным недостатком по сравнению со стратегией нокаута генов13. Следующий остаточный эффект генного уровня может влиять на реальные фенотипы. Чтобы обеспечить успешное лечение РНКи, необходимо учитывать несколько существенных условий, включая физическое состояние животных, выбор контрольной группы, длину и концентрацию молекул дцРНК, избежание возможности нецелевых эффектов (OTE) и различную чувствительность тканей к дцРНК.
Физическое состояние P. americana
Здоровые животные являются предпосылкой успеха РНКи и различных генных функциональных исследований у P. americana. Кроме того, чтобы эксперименты были последовательными, выбираются только тараканы, которые были выращены в тех же условиях. И только нимфы, которые старше3-й звезды (около 19 дней после вылупления), могут быть использованы, потому что более молодые нимфы слишком малы для инъекций по размеру тела.
Выбор контрольной группы
dsMock11 и dsEGFP и та же доза тараканского физиологического раствора6 были использованы в качестве отрицательного контроля. Целевые последовательности отрицательных контрольных групп должны быть экзогенными и не иметь гомологии с эндогенной генетической последовательностью11. dsMock был предпочтительным, потому что использование dsEGFP задержало бы рост и развитие P. americana в определенной степени.
длина дцРНК
На эффективность РНКи влияет длина молекул дцРНК. Более длинные фрагменты дцРНК более эффективны при глушении мРНК, возможно, потому, что она производит больше siRNAs, или более короткие фрагменты дцРНК поглощаются клетками менее эффективно 1. У P. americana и B. germanica дцРНК между 300 bp и 800 bp представляется идеальной для экспериментов RNAi 6,9,10,14. Короткая дцРНК может быть недостаточной для индуцирования системного ответа РНКи, тогда как длинная дцРНК может увеличить риск OTE1.
концентрация дцРНК
Концентрация дцРНК также может влиять на эффективность РНКи 1,15. Для3-й звездной нимфы P. americana 1 мкг дцРНК представляется разумным количеством, а 4-6 мкг подходит для взрослых 6,9,14,16. Точное количество дцРНК, используемое для инъекций, может быть скорректировано на основе генов, тканей и размера тела P. americana.
Нецелевые эффекты
OTE RNAi трудно избежать в общей сложности17,18. Две неперекрывающиеся области дцРНК могут быть спроектированы таким образом, чтобы уменьшить влияние OTE на фенотипы5. Если дцРНК, нацеленные на две различные области, дают одинаковый эффект, возможность ложноположительного явления, вызванного OTE, может быть исключена.
Метод определения эффективности РНКи
Фенотипический анализ является наиболее интуитивным подходом к оценке РНКи, а qRT-PCR и западный блоттинговый анализ являются двумя золотыми стандартами для измерения эффективности нокдауна. qRT-PCR является простым методом определения эффективности интерференции на уровне мРНК 6,9,10. Праймеры должны быть спроектированы вне области нацеливания дцРНК. Вестерн-блоттинговый анализ является еще одним методом анализа интерференции на уровне белка, но требует специфических антител. Однако никаких особых фенотипических эффектов иногда не наблюдается, даже при высокой эффективности глушения (>90%). Одним из возможных объяснений этого остаточного эффекта является массивное расширение семейства генов у тараканов; избыточность генов контролирует многие конкретные функции и фенотипы. Другое возможное объяснение заключается в том, что минимальный уровень экспрессии генов, необходимый для функционирования достаточно, чрезвычайно низок. Они приводят к сбою в получении определенного фенотипа даже при достаточно высокой эффективности РНКи.
Тканеспецифичность чувствительности к РНК
Эффективность интерференции в некоторых тканях таракана (таких как яичник и вспомогательные железы) недостаточно высока, что может быть проникающим барьером для дцРНК 5,19; также наблюдается различная эффективность РНКи у разных видов насекомых, которая зависит от ферментативной деградации дцРНК в гемолимфе15,20. Несколько идей являются разумными для повышения эффективности РНКi в тканях P. americana, таких как переваривание дцРНК в siRNAs in vitro21, увеличение дозы дцРНК и времени инъекции, а также использование наноматериалов в качестве носителя для доставки.
В заключение, высокая эффективность РНКi вместе с хорошо аннотированными последовательностями генома9 делает P. americana хорошей моделью для исследования функции генов в широком спектре исследований развития, физиологии и поведения. Аналогичным образом, этот отчет может служить ценным справочным материалом для других насекомых, чувствительных к дцРНК и трудно поддающихся нокаутирующим мутациям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 32070500, 31620103917, 31330072 и 31572325 C.R., Sh.L.), Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2021B1515020044 и 2020A1515011267 к C.R.), Департаментом науки и техники провинции Гуандун (грант NoNo 2019B090905003 и 2019A0102006), Департаментом науки и техники в Гуанчжоу (грант No 202102020110), Шэньчжэньской научно-технической программой (Грант No. KQTD20180411143628272 к Ш.Л.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
