Summary
El presente protocolo describe las pautas paso a paso para las técnicas de operación de ARNi en P. americana.
Abstract
Las cucarachas, una plaga sanitaria, son especies esenciales en el desarrollo de insectos y estudios metamórficos debido a su fácil alimentación y características hemimetábolas. Junto con secuencias genómicas bien anotadas, estas ventajas han hecho de la cucaracha americana, Periplaneta americana, un importante modelo de insecto hemimetábolo. Limitado por la escasez de estrategia de knockout, el knockdown de genes efectivo basado en la interferencia de ARN (RNAi) se convierte en una técnica indispensable en la investigación de genes funcionales de P. americana. El presente protocolo describe las técnicas de operación de ARNi en P. americana. El protocolo incluye (1) la selección de la P. americana en las etapas de desarrollo adecuadas, (2) la preparación para el ajuste de la inyección, (3) la inyección de dsRNA y (4) la detección de la eficiencia de derribo de genes. El ARNi es una poderosa herramienta genética inversa en P. americana. La mayoría de los tejidos de P. americana son sensibles al dsRNA extracelular. Su simplicidad permite a los investigadores obtener rápidamente fenotipos disfuncionales bajo una o múltiples inyecciones de dsRNA dirigidas, lo que permite a los investigadores utilizar mejor la P. americana para estudios de desarrollo y metamórficos.
Introduction
La interferencia de ARN (RNAi), un mecanismo conservado evolutivamente, se convierte gradualmente en una herramienta genética inversa esencial para inhibir la expresión génica en muchos organismos1, ya que Andrew Fire y Craig Mello2 desarrollaron la estrategia de silencio genético mediado por ARN de doble cadena (dsRNA). El dsRNA se escinde en fragmentos de 21-23 nucleótidos, pequeños ARN interferentes (siRNAs), por la enzima Dicer en las células para activar la vía del ARNi. Luego, los siRNAs se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que se acopla al ARNm objetivo, causa la escisión del ARNm y finalmente resulta en la pérdida de la funcióndel gen 3,4,5. Entre las especies de insectos, hasta ahora se han reportado muchos experimentos sistémicos de ARNi en muchos órdenes de insectos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera y Blattodea 5,6,7,8.
Las cucarachas (Blattaria) son una familia de insectos esenciales en estudios de desarrollo y metamórficos con sus ciclos de crecimiento rápido, fuerte adaptabilidad al medio ambiente y alta plasticidad de desarrollo9. Antes de descubrir que el ARNi era compatible con las cucarachas, las investigaciones anteriores solo se centraron en la prevención y el control de las cucarachas debido a la escasez de técnicas de manipulación genética en las cucarachas. La estructura única de la cucaracha ootheca hizo que fuera un desafío realizar la eliminación de genes basada en inyección de embriones con el sistema CRISPR-Cas9. Además, la mayoría de los tejidos de las cucarachas (como P. americana) muestran una respuesta arNi sistémica robusta, lo que permite la rápida generación de fenotipos disfuncionales mediante la inyección de uno o más dsRNAsdirigidos 9,10,11. Estas características hicieron del ARNi una técnica indispensable en la investigación funcional génica en P. americana.
A pesar de que se ha informado del uso de ARNi en la investigación de genes funcionales en P. americana , no se disponía de una descripción detallada o paso a paso. Este informe proporciona una guía operativa paso a paso para el ARNi en P. americana, útil para el estudio de la función génica en otras cucarachas. Además, esta guía no se limita a Blattodea y se puede aplicar a muchos otros insectos con modificaciones menores.
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Protocol
La línea de P. americana fue proporcionada inicialmente por el Dr. Huiling Hao. Esta especie se ha mantenido con endogamia durante 30 años9.
1. Eclosión y alimentación de P. americana
- Recolecte ootecas frescas (inmediatamente después de la puesta de huevos) de P. americana e incube en la incubadora oscura a 25 ° C y 60% de humedad durante ~ 25 días. Luego aumente la temperatura y la humedad a 30 ° C y 75% 3 días antes de la eclosión.
- Use un tamiz con una apertura de 4 mm para separar las ninfas eclosionadas de las ootecas.
- Mantenga las ninfas en recipientes cilíndricos (12 cm de diámetro y 10 cm de altura) en la oscuridad a 28 ° C, 70% de humedad. Cepille el borde interior de los recipientes con vaselina para evitar que las cucarachas se escapen. Proporcione comida para ratas, agua y refugio (bandejas de huevos). Preste atención a la actividad de las ninfas y limpie regularmente las heces y los escombros.
2. Selección de las ninfas en el instar adecuado
- Use un tubo de vidrio para elegir la P. americana recién muda (color blanco en el cuerpo). Manténgalos en recipientes nuevos y espere la etapa correcta para el tratamiento.
NOTA: Después de ~ 19 días bajo las condiciones de alimentación anteriores, las ninfas en el3er instars estarán disponibles para inyección. El color de las cucarachas recién mudadas es blanco, y las estrellas se aclaran mediante tiempos de muda.
3. Preparación del fragmento objetivo con los promotores T7
- Utilizando el ADNc de P. americana como plantilla, diseñó cebadores pareados para realizar PCR para obtener un fragmento de ADN de 300-800 pb del gen diana9. A continuación, clone el fragmento de PCR en un vector pTOPO (ver Tabla de Materiales) para su secuenciación.
- Utilizando el fragmento diana de ADN como plantilla, sintetizar un nuevo par de cebadores con secuencia promotora T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') en los terminales 5' y realizar otra ronda de PCR para obtener el fragmento diana con promotores T7 en cada lado9.
4. Transcripción y síntesis de dsRNA in vitro
- Añadir 10 μL de T7 2X Buffer, 2 μL de Enzyme Mix, T7 Express (ver Tabla de Materiales) y 2 μg de producto de PCR (obtenido en el paso 3.2) en el sistema de reacción y sumar el volumen total a 20 μL con ddH2O. Mezclar suavemente boca abajo manualmente e incubar a 37 °C durante 30 min y 70 °C durante 10 min, y luego enfriar lentamente a temperatura ambiente.
- Solución diluida de RNasa A (4 μg/μL) con ddH2O en una proporción de 1:200. A continuación, agregue 1 μL de DNasa libre de RQ1 RNasa (1 U/μL) y 1 μL de solución diluida de RNasa A al sistema (consulte la Tabla de Materiales).
NOTA: Ahora, el volumen de un solo sistema es de 22 μL. - Incubar a 37 °C durante 30 min. Luego agregue el 10% del volumen total (al realizar reacciones N simultáneamente, el volumen total es N x 22 μL) de acetato de sodio y tres volúmenes del volumen total de isopropanol.
- Mezclar suavemente boca abajo manualmente, colocar sobre hielo durante 5 min y centrifugar a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante con una pipeta, lave el residuo con etanol al 75% (con agua tratada con 25% de pirocarbonato dietílico (DEPC)) y luego centrífique a 13.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante de nuevo. Seque el pellet al aire durante 15 minutos a temperatura ambiente. Use ~ 100 μL de agua DEPC para disolver dsRNA, luego diluya el dsRNA a los 2 μg / μL finales.
NOTA: El dsRNA podría almacenarse a -80 °C durante 6 meses.
5. Carga de la solución de dsRNA en la jeringa
- Configure el programa en la bomba de microinyección (consulte la Tabla de materiales) con anticipación para garantizar que el volumen de cada inyección sea consistente. Antes de usar la jeringa, limpie la jeringa llenándola con agua DEPC 8-10 veces.
- Instale la jeringa de 10 μL en la bomba de microinyección, encienda la bomba y llene la jeringa con 10 μL de solución de dsRNA (preparada en el paso 4.6). Inyecte 1 μL del dsRNA en una3ª ninfa instar (consulte el paso 2) y asegúrese de que no se filtre al cuerpo.
6. Inyección de dsRNA a P. americana
- Anestesiar las cucarachas con una mayor concentración de CO2 en un recipiente hasta que las cucarachas ya no se muevan, y luego proceder inmediatamente con la inyección.
- Levante suavemente la cucaracha con pinzas y entregue la cucaracha hacia la aguja con la mano. A continuación, inserte la aguja a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis. Acerca de la profundidad de inserción, cuanto menos profundo, mejor.
- Luego, inyecte la solución de dsRNA en la cucaracha. Finalmente, saque la punta de la aguja. Asegúrese de que la punta de la aguja esté lo más cerca posible de la epidermis para evitar dañar los órganos internos.
NOTA: La inyección debe hacerse bajo un microscopio de disección. - Coloque las cucarachas inyectadas en recipientes limpios de bioensayo. Espere unos 10-20 minutos para que se recuperen de los efectos del CO2 . Etiquete los envases con la fecha de inyección, el tipo y la dosis de dsRNA, y la edad de la P. americana.
- Coloque las cucarachas inyectadas en un ambiente oscuro a 28 ° C, 70% de humedad, proporcione agua, alimento y refugio, y observe posibles cambios en el fenotipo de las cucarachas regularmente.
7. Confirmación de derribo y análisis fenotípico
- Evalúe la eficiencia del ARNi utilizando cualquier técnica de biología molecular disponible, como la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y western blotting. Para conocer los procedimientos detallados de qRT-PCR y Western blotting, consulte las Referencias 1,12.
- Para observar y analizar fenotipos relacionados con el ARNi, utilice el microscopio adecuado para animales vivos.
NOTA: El ARNi puede afectar la morfología, el comportamiento, la muda, la regeneración de las extremidades y otras actividades fisiológicas de las cucarachas. La frecuencia específica del fenotipo se calcula de acuerdo con condiciones específicas.
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Representative Results
La Figura 1 muestra una inyección exitosa. La jeringa de microinyección con una aguja de micro diámetro debe colocarse horizontalmente en el amplificador (Figura 1A). La aguja se inserta a través del espacio entre dos somitas abdominales horizontalmente contra la epidermis (Figura 1B). Asegúrese de que el líquido entre en el abdomen de P. americana . El ángulo demasiado pronunciado de la aguja dañará los órganos internos (Figura 1C), y la inyección inadecuada conduce a la fuga de la solución de dsRNA fuera del abdomen (Figura 1D). Si se filtra algún dsRNA, el animal debe descartarse y se realiza otra inyección. La P. americana necesita ser completamente anestesiada durante la inyección.
Al igual que otros experimentos biológicos, se necesitan grupos de control cuando se realiza el tratamiento con ARNi. Las diferencias de tratamiento deben confirmarse causadas por el ARNi dirigido en lugar de debido a los efectos fuera del objetivo del dsRNA, el daño durante la inyección o la anestesiacon CO 2 . Aquí se seleccionaron los genes Ddc (Dopa descarboxilasa) y Dpp (decapentapléjico) como dos ejemplos para observar el fenotipo de las cucarachas mudas después de la inyección de dsRNA, y se realizó un control negativo dsMock11 que no tiene objetivo en los animales, como control negativo, la eficiencia del ARNi se detectó mediante qRT-PCR (Figura 2). Tomando como ejemplo la inyección de dsDdc (Figura 3A, B), la P. americana con el gen Ddc derribado tendría la epidermis blanca durante mucho tiempo ya que la melanización está bloqueada (Figura 3B). En el experimento de las inyecciones de dsDpp , que son necesarias para la regeneración de las extremidades, el ARNi interrumpió la regeneración de las extremidades (Figura 4), que se informó previamente9.
Figura 1: Instrumento y operación correcta de inyección. (A) La jeringa en el instrumento de microinyección. (B) Posición correcta de la aguja de inyección; no sale líquido. (C) El ángulo demasiado pronunciado de la aguja de inyección puede dañar los órganos internos. (D) La inyección fallida da como resultado que la solución de dsRNA o la hemolinfa fluyan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Eficiencia de ARNi detectada por qRT-PCR. La eficiencia de derribo de los genes Ddc y Dpp se detectó mediante qRT-PCR, y el dsMock se utilizó como control negativo. Se utilizaron tres réplicas para cada tratamiento, y las barras de error indican la desviación estándar de las tres réplicas. La importancia de las diferencias fue analizada por la prueba t de Student. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de ARNi exitoso para la interrupción de la melanización de la epidermis en P. americana. (A) Cucaracha normal después de la inyección dedsMock con melanización normal. (B) Ddc RNAi mediado por P. americana albinista después de la muda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplos de ARNi exitoso para la interrupción de la regeneración de extremidades en P. americana. (A) A P. americana con una pierna trasera amputada. (B-C) P. americana después de tratamientos de ARNi y muda. La pata trasera se regeneró en el grupo de control dsMock (B), pero no cuando se silenció el gen Dpp (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este informe describió una estrategia metodológica de ARNi paso a paso en P. americana; Cabe destacar que también se puede aplicar a otras cucarachas (Blattella germanica, por ejemplo) y muchos otros insectos con cambios menores. Sin embargo, la eficiencia de silenciamiento génico del ARNi no siempre es lo suficientemente alta, con una desventaja obvia en comparación con la estrategia de eliminaciónde genes 13. El siguiente efecto residual a nivel de gen puede interferir con los fenotipos reales. Para garantizar que el tratamiento con ARNi sea exitoso, se deben considerar varias condiciones esenciales, incluida la condición física de los animales, la selección del grupo de control, la longitud y la concentración de las moléculas de dsRNA, la evitación de la posibilidad de efectos fuera del objetivo (OTE) y la diferente sensibilidad de los tejidos al dsRNA.
Condición física de P. americana
Los animales sanos son la premisa para el éxito del ARNi y de diferentes estudios funcionales genéticos en P. americana. Además, para mantener los experimentos consistentes, solo se eligen cucarachas que se han criado en las mismas condiciones. Y solo se pueden usar ninfas que son mayores que la3ª estrella (aproximadamente 19 días después de la eclosión) porque las ninfas más jóvenes son demasiado pequeñas para inyectarlas en tamaño corporal.
Selección del grupo de control
dsMock11 y dsEGFP y la misma dosis de solución salina de cucaracha6 se han utilizado como controles negativos. Las secuencias diana de los controles negativos deben ser exógenas y no tener homología con la secuencia genética endógena11. dsMock fue preferido porque el uso de dsEGFP retrasaría el crecimiento y desarrollo de P. americana hasta cierto punto.
Longitud del dsRNA
La eficiencia del ARNi se ve afectada por la longitud de las moléculas de dsRNA. Los fragmentos de dsRNA más largos son más efectivos en el silenciamiento de ARNm, posiblemente porque produce más siRNAs, o los fragmentos de dsRNA más cortos son absorbidos por las células de manera menos eficiente 1. En P. americana y B. germanica, el dsRNA entre 300 pb y 800 pb parece ideal para experimentos de ARNi 6,9,10,14. Un dsRNA corto puede ser insuficiente para inducir una respuesta sistémica de ARNi, mientras que un dsRNA largo puede aumentar el riesgo de OTE1.
Concentración de dsRNA
La concentración de dsRNA también puede influir en la eficiencia del ARNi 1,15. Para las3ª ninfas instar de P. americana, 1 μg de dsRNA parece ser una cantidad razonable, y 4-6 μg es adecuado para adultos 6,9,14,16. La cantidad precisa de dsRNA utilizada para la inyección se puede ajustar en función de los genes, los tejidos y el tamaño corporal de la P. americana.
Efectos fuera del objetivo
El OTE de RNAi es difícil de evitar en conjunto 17,18. Se pueden diseñar dos regiones no superpuestas del dsRNA para reducir el efecto de la OTE sobre los fenotipos5. Si los dsRNAs dirigidos a dos regiones distintas producen el mismo efecto, se podría excluir la posibilidad de un fenómeno de falsos positivos inducido por OTE.
Método para la detección de la eficiencia del ARNi
El análisis fenotípico es el enfoque más intuitivo para evaluar el ARNi, y el análisis qRT-PCR y Western blotting son los dos estándares de oro para medir la eficiencia de derribo. qRT-PCR es un método sencillo para determinar la eficiencia de interferencia a nivel de ARNm 6,9,10. Los cebadores deben diseñarse fuera de la región de destino de dsRNA. El análisis de Western blotting es otro método para analizar la interferencia a nivel de proteína, pero requiere anticuerpos específicos. Sin embargo, a veces no se observan efectos fenotípicos particulares, incluso con una alta eficiencia de silenciamiento (>90%). Una posible explicación para este efecto residual es la expansión masiva de la familia de genes en las cucarachas; las redundancias de los genes controlan muchas funciones y fenotipos particulares. Otra posible explicación es que el nivel mínimo de expresión génica requerido para funcionar lo suficiente es extremadamente bajo. Estos conducen a la falla en la obtención de un fenotipo particular, incluso con una eficiencia de ARNi lo suficientemente alta.
Especificidad tisular para la sensibilidad al ARNi
La eficiencia de interferencia en algunos tejidos de cucarachas (como el ovario y las glándulas accesorias) no es lo suficientemente alta, lo que podría ser la barrera penetrante para el dsRNA 5,19; también se observa la diferente eficacia del ARNi en diferentes especies de insectos, lo que depende de la degradación enzimática del dsRNA en la hemolinfa15,20. Algunas ideas son razonables para mejorar la eficiencia del ARNi en los tejidos de P. americana, como digerir el dsRNA en siRNAs in vitro21, aumentar la dosis de dsRNA y los tiempos de inyección, y usar nanomateriales como portadores para la entrega.
En conclusión, la alta eficiencia del ARNi junto con secuencias genómicas bien anotadas9 hace de P. americana un buen modelo para investigar la función génica en una amplia gama de estudios de desarrollo, fisiológicos y de comportamiento. Del mismo modo, este informe puede servir como una referencia valiosa para otros insectos sensibles al dsRNA y mutaciones difíciles de hacer knockout.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 y 31572325 a C.R., Sh.L.), por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 y 2020A1515011267 a C.R.), por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 y 2019A0102006), por el Departamento de Ciencia y Tecnología en Guangzhou (Grant No. 202102020110), por el Programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (Subvención No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
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