Summary
Detta protokoll beskriver steg-för-steg-riktlinjer för RNAi-operationsteknikerna i P. americana.
Abstract
Kackerlackor, ett sanitärt skadedjur, är viktiga arter i insektsutvecklings- och metamorfa studier på grund av deras enkla utfodring och hemimetabola egenskaper. Sammantaget med väl kommenterade genomsekvenser har dessa fördelar gjort amerikansk kackerlacka, Periplaneta americana, till en viktig hemimetabol insektsmodell. Begränsad av bristen på knockout-strategi blir effektiv RNA-interferens (RNAi) -baserad genknockdown en oumbärlig teknik i funktionell genforskning av P. americana. Föreliggande protokoll beskriver RNAi-operationsteknikerna i P. americana. Protokollet innefattar (1) val av P. americana vid lämpliga utvecklingsstadier, (2) förberedelse för injektionsinställningen, (3) dsRNA-injektion och (4) detektering av gennedslagningseffektivitet. RNAi är ett kraftfullt omvänd genetiskt verktyg i P. americana. Majoriteten av P. americana vävnader är känsliga för extracellulärt dsRNA. Dess enkelhet gör det möjligt för forskare att snabbt få dysfunktionella fenotyper under en eller flera riktade dsRNA-injektioner, vilket gör det möjligt för forskare att bättre använda P. americana för utvecklings- och metamorfa studier.
Introduction
RNA-interferens (RNAi), en evolutionärt bevarad mekanism, blir gradvis ett viktigt omvänd genetiskt verktyg för att hämma genuttryck i många organismer1, eftersom Andrew Fire och Craig Mello2 utvecklade den dubbelsträngade RNA (dsRNA) medierade gentystningsstrategin. dsRNA klyvs i fragment av 21-23 nukleotider, små interfererande RNA (siRNA), av enzymet Dicer i celler för att aktivera RNAi-vägen. Därefter införlivas siRNA i det RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC), som kopplas till mål-mRNA, orsakar mRNA-klyvning och slutligen resulterar i förlust av genfunktion 3,4,5. Bland insektsarterna har många systemiska RNAi-experiment hittills rapporterats i många insektsordningar, såsom Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera och Blattodea 5,6,7,8.
Kackerlackor (Blattaria) är en viktig insektsfamilj i utvecklings- och metamorfa studier med sina snabba tillväxtcykler, starka anpassningsförmåga till miljön och hög utvecklingsplasticitet9. Innan man upptäckte att RNAi var kompatibel med kackerlackor, fokuserade tidigare forskning endast på förebyggande och kontroll av kackerlacka på grund av brist på genetiska manipulationstekniker i kackerlackor. Kackerlackan oothecas unika struktur gjorde det utmanande att utföra embryoinjektionsbaserad genknockout med CRISPR-Cas9-systemet. Dessutom visar de flesta vävnader i kackerlackor (såsom P. americana) robust systemiskt RNAi-svar, vilket möjliggör snabb generering av dysfunktionella fenotyper genom att injicera en eller flera riktade dsRNA 9,10,11. Dessa egenskaper gjorde RNAi till en oumbärlig teknik inom genfunktionell forskning i P. americana.
Även om användningen av RNAi i funktionell genforskning i P. americana har rapporterats, var ingen detaljerad eller steg-för-steg-beskrivning tillgänglig. Denna rapport ger en steg-för-steg operativ riktlinje för RNAi i P. americana, användbar för genfunktionsstudie i andra kackerlackor. Dessutom är denna guide inte begränsad till Blattodea och kan tillämpas på många andra insekter med mindre modifieringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Linjen av P. americana tillhandahölls ursprungligen av Dr. Huiling Hao. Denna art har bibehållits med inavel i 30 år9.
1. Kläckning och utfodring av P. americana
- Samla färsk oothecae (omedelbart efter äggläggning) av P. americana och inkubera i den mörka inkubatorn vid 25 ° C och 60% fuktighet i ~ 25 dagar. Öka sedan temperaturen och luftfuktigheten till 30 °C och 75 % 3 dagar före kläckning.
- Använd en sil med 4 mm bländare för att separera de kläckta nymferna från oothecae.
- Förvara nymferna i cylindriska behållare (12 cm i diameter och 10 cm i höjd) i mörker vid 28 °C, 70 % luftfuktighet. Borsta behållarens insida med vaselin för att förhindra att kackerlackor flyr. Ge råtta mat, vatten och skydd (äggbrickor). Var uppmärksam på nymfernas aktivitet och rengör regelbundet avföring och skräp.
2. Val av nymfer i rätt instar
- Använd ett glasrör för att plocka ut den nysmälta P. americana (vit i kroppsfärg). Förvara dem i nya behållare och vänta på rätt behandlingsstadium.
OBS: Efter ~ 19 dagar under ovanstående utfodringsförhållanden kommer nymferna i 3: e instars att vara tillgängliga för injektion. Färgen på nysmälta kackerlackor är vit och instjärnorna klargörs genom smälttider.
3. Förberedelse av målfragmentet med T7-initiativtagare
- Med hjälp av cDNA av P. americana som mall, designa parade primers för att utföra PCR för att erhålla 300-800 bp DNA-fragment av målgenen9. Klona sedan PCR-fragmentet till en pTOPO-vektor (se Materialtabell) för sekvensering.
- Använd målfragmentets DNA som mall, syntetisera ett nytt par primers med T7-promotorsekvens (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') vid 5'-terminalerna och utför ytterligare en omgång PCR för att erhålla målfragmentet med T7-promotorer på varje sida9.
4. Transkription och syntes av dsRNA in vitro
- Tillsätt 10 μL T7 2X buffert, 2 μL av enzymblandningen, T7 Express (se materialtabell) och 2 μg PCR-produkt (erhållen i steg 3.2) i reaktionssystemet och tillsätt den totala volymen till 20 μL med ddH2O. Blanda försiktigt upp och ner manuellt och inkubera vid 37 °C i 30 minuter och 70 °C i 10 min, och svalna sedan långsamt till rumstemperatur.
- Späd RNas A-lösning (4 μg/μL) medddH2Oi förhållandet 1:200. Tillsätt sedan 1 μL RQ1 RNasfri DNas (1 U/μL) och 1 μL utspädd RNas A-lösning till systemet (se Materialförteckningen).
OBS: Nu är volymen för ett enda system 22 μL. - Inkubera vid 37 ° C i 30 min. Tillsätt sedan 10% av den totala volymen (vid utförande av N-reaktioner samtidigt är den totala volymen N x 22 μL) natriumacetat och tre volymer av den totala volymen isopropanol.
- Blanda försiktigt upp och ner manuellt, lägg på is i 5 minuter och centrifug vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten med en pipett, tvätta återstoden med 75 % etanol (med 25 % dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlat vatten) och centrifug sedan vid 13 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatant igen. Lufttorka pelletsen i 15 min vid rumstemperatur. Använd ~ 100 μL DEPC-vatten för att lösa upp dsRNA och späd sedan dsRNA till de slutliga 2 μg / μL.
OBS: DSRNA kan lagras vid -80 ° C i 6 månader.
5. Laddar dsRNA-lösning i sprutan
- Ställ in programmet i mikroinsprutningspumpen (se Materialtabell) i förväg för att säkerställa att volymen för varje injektion är konsekvent. Innan du använder sprutan, rengör sprutan genom att fylla den med DEPC-vatten 8-10 gånger.
- Installera 10 μL-sprutan på mikroinsprutningspumpen, starta pumpen och fyll sprutan med 10 μL dsRNA-lösning (beredd vid steg 4.6). Injicera 1 μL av dsRNA i en 3: e instar nymf (se steg 2) och se till att den inte läcker ut till kroppen.
6. Injicera dsRNA till P. americana
- Bedöva kackerlackorna med en ökad koncentration av CO2 i en behållare tills kackerlackorna inte rör sig längre och fortsätt sedan omedelbart med injektionen.
- Plocka försiktigt upp kackerlacka med pincett och leverera kackerlacka mot nålen med handen. Sätt sedan in nålen via klyftan mellan två buksomiter horisontellt mot överhuden. Om skärdjup, ju grundare, desto bättre.
- Injicera sedan dsRNA-lösningen i kackerlacka. Dra slutligen ut nålspetsen. Se till att nålspetsen är så nära epidermis som möjligt för att undvika att skada inre organ.
OBS: Injektionen ska göras under ett dissektionsmikroskop. - Lägg de injicerade kackerlackorna i rena bioassaybehållare. Vänta ca 10-20 min för att låta dem återhämta sig från CO2-effekterna . Märk behållarna med datum för injektion, typ och dos av dsRNA och ålder av P. americana.
- Placera de injicerade kackerlackorna i en mörk miljö vid 28 ° C, 70% luftfuktighet, ge vatten, foder och skydd och observera eventuella förändringar i kackerlackornas fenotyp regelbundet.
7. Knockdown-bekräftelse och fenotypisk analys
- Utvärdera effektiviteten av RNAi med hjälp av alla tillgängliga molekylärbiologiska tekniker såsom kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) och Western blotting. För detaljerade qRT-PCR- och Western blotting-procedurer, se Referenser 1,12.
- För att observera och analysera RNAi-relaterade fenotyper, använd mikroskopet som är lämpligt för levande djur.
OBS: RNAi kan påverka morfologi, beteende, smältning, lemregenerering och andra fysiologiska aktiviteter hos kackerlackor. Den specifika frekvensen av fenotyp beräknas enligt specifika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar en lyckad injektion. Mikroinjektionssprutan med en nål med mikrodiameter ska placeras horisontellt på boostern (figur 1A). Nålen sätts in via gapet mellan två buksomiter horisontellt mot överhuden (figur 1B). Se till att vätskan går in i P. americana buken. Nålens för branta vinkel kommer att skada de inre organen (figur 1C), och felaktig injektion leder till läckage av dsRNA-lösningen ut ur buken (figur 1D). Om något dsRNA läcker ut måste djuret kasseras och en annan injektion utförs. P. americana måste sövas fullständigt under injektionen.
Liksom andra biologiska experiment behövs kontrollgrupper när RNAi-behandling utförs. Behandlingsskillnaderna måste bekräftas orsakade av riktad RNAi istället för på grund av de off-target effekterna av dsRNA, skadan under injektionen eller CO2-anestesi. Här valdes Ddc (Dopa dekarboxylas) och Dpp (dekapentaplegiska) gener som två exempel för att observera fenotypen hos de smälta kackerlackorna efter dsRNA-injektion, och en negativ kontroll dsMock11 som inte har något mål hos djuren, utfördes som en negativ kontroll, RNAi-effektiviteten detekterades av qRT-PCR (Figur 2). Med injektionen av dsDdc som exempel (figur 3A,B) skulle P. americana med nedslagen Ddc-gen ha den vita epidermis under lång tid eftersom melaniseringen är blockerad (Figur 3B). I experimentet med dsDpp-injektioner, som är nödvändiga för regenerering av lemmar, störde RNAi lemregenereringen (figur 4), som rapporterades tidigare9.
Figur 1: Instrument och korrekt injektionsoperation. (A) Sprutan på mikroinjektionsinstrumentet. (B) Injektionsnålens korrekta placering. ingen vätska kommer ut. (C) Den för branta vinkeln på injektionsnålen kan skada de inre organen. (D) Misslyckad injektion resulterar i att dsRNA-lösningen eller hemolymfen flyter ut. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: RNAi-effektivitet detekterad av qRT-PCR. Knockdown-effektiviteten hos Ddc - och Dpp-generna detekterades av qRT-PCR, och dsMock användes som en negativ kontroll. Tre replikat användes för varje behandling, och felstaplarna indikerar standardavvikelse för de tre replikaten. Betydelsen av skillnader analyserades av Studentens t-test. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på framgångsrik RNAi för störning av epidermis melanisering i P. americana. (A) Normal kackerlacka efter injektion avdsMock med normal melanisering. (B) Ddc RNAi medierade albinistiska P. americana efter smältning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på framgångsrik RNAi för störning av lemregenerering i P. americana. (A) A P. americana med ett amputerat bakben. (B-C) P. americana efter RNAi-behandlingar och smältning. Bakbenet regenererades i dsMock kontrollgrupp (B) men inte när Dpp (C) -genen tystades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport beskrev en metodologisk steg-för-steg-RNAi-strategi i P. americana; Observera att det också kan appliceras på andra kackerlackor (till exempel Blattella germanica ) och många andra insekter med mindre förändringar. RNAi: s gendämpningseffektivitet är emellertid inte alltid tillräckligt hög, med en uppenbar nackdel jämfört med genknockoutstrategin13. Följande kvarvarande effekt av gennivå kan störa de verkliga fenotyperna. För att säkerställa att RNAi-behandlingen är framgångsrik måste flera väsentliga villkor beaktas, inklusive djurens fysiska tillstånd, val av kontrollgrupp, längden och koncentrationen av dsRNA-molekylerna, undvikande av risken för Off-target-effekter (OTE) och olika känslighet hos vävnader för dsRNA.
Fysiskt tillstånd hos P. americana
Friska djur är förutsättningen för framgången med RNAi och olika genfunktionella studier i P. americana. Dessutom, för att hålla experimenten konsekventa, väljs endast kackerlackor som har höjts under samma förhållanden. Och endast nymfer som är äldre än dentredje instar (cirka 19 dagar efter kläckning) kan användas eftersom yngre nymfer är för små för injektion i kroppsstorlek.
Val av kontrollgrupp
dsMock11 och dsEGFP och samma dos kackerlacka saltlösning6 har använts som negativa kontroller. Målsekvenserna för negativa kontroller bör vara exogena och inte ha någon homologi med den endogena genetiska sekvensen11. dsMock var att föredra eftersom användning av dsEGFP skulle försena tillväxten och utvecklingen av P. americana till en viss grad.
dsRNA-längd
Effektiviteten hos RNAi påverkas av längden på dsRNA-molekylerna. Längre dsRNA-fragment är effektivare vid mRNA-tystnad, möjligen för att det producerar fler siRNA, eller kortare dsRNA-fragment tas upp av celler mindre effektivt 1. I P. americana och B. germanica verkar dsRNA mellan 300 bp och 800 bp idealiskt för RNAi-experiment 6,9,10,14. Ett kort dsRNA kan vara otillräckligt för att inducera ett systemiskt RNAi-svar, medan ett långt dsRNA kan öka OTE-risken1.
dsRNA-koncentration
Koncentrationen av dsRNA kan också påverka effektiviteten hos RNAi 1,15. För detredje instarnymferna av P. americana verkar 1 μg dsRNA vara en rimlig mängd och 4-6 μg är lämplig för vuxna 6,9,14,16. Den exakta dsRNA-mängden som används för injektion kan justeras baserat på generna, vävnaderna och kroppsstorleken hos P. americana.
Effekter utanför målet
OTE för RNAi är svårt att undvika totalt17,18. Två icke-överlappande regioner av dsRNA kan utformas för att minska effekten av OTE på fenotyper5. Om dsRNA som riktar sig mot två distinkta regioner ger samma effekt kan möjligheten till OTE-inducerat falskt positivt fenomen uteslutas.
Metod för RNAi-effektivitetsdetektering
Den fenotypiska analysen är det mest intuitiva tillvägagångssättet för att utvärdera RNAi, och qRT-PCR och Western blotting-analys är de två gyllene standarderna för att mäta knockdown-effektivitet. qRT-PCR är en enkel metod för att bestämma interferenseffektivitet vid mRNA-nivå 6,9,10. Primrar bör utformas ur dsRNA-inriktningsregionen. Western blotting-analysen är en annan metod för att analysera interferens på proteinnivå men kräver specifika antikroppar. Emellertid observeras inga speciella fenotypiska effekter ibland, även med hög ljuddämpningseffektivitet (>90%). En möjlig förklaring till denna kvarvarande effekt är massiv genfamiljsexpansion i kackerlackor; genernas redundans styr många speciella funktioner och fenotyper. En annan möjlig förklaring är att den minsta genuttrycksnivå som krävs för funktionell nog är extremt låg. Dessa leder till misslyckande med att erhålla en viss fenotyp även med tillräckligt hög RNAi-effektivitet.
Vävnadsspecificitet för RNAi-känsligheten
Interferenseffektiviteten i vissa kackerlackavävnader (såsom äggstocks- och tillbehörskörtlarna) är inte tillräckligt hög, vilket kan vara den penetrerande barriären för dsRNA 5,19; den olika RNAi-effekten hos olika insektsarter observeras också, vilket beror på den enzymatiska nedbrytningen av dsRNA i hemolymf15,20. Några idéer är rimliga för att förbättra RNAi-effektiviteten i P. americana-vävnader, såsom att smälta dsRNA till siRNA in vitro21, öka dsRNA-dosen och injektionstiderna och använda nanomaterial som bärare för leverans.
Sammanfattningsvis gör den höga effektiviteten hos RNAi tillsammans med väl kommenterade genomsekvenser9 P. americana till en bra modell för att undersöka genfunktionen i ett brett spektrum av utvecklings-, fysiologiska och beteendestudier. På samma sätt kan denna rapport fungera som en värdefull referens för andra insekter som är känsliga för dsRNA och svåra att göra knockout-mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 och 31572325 till C.R., Sh.L.), av Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2021B1515020044 and 2020A15111267 to C.R.), av Department of Science and Technology i Guangdongprovinsen (Grant Nos. 2019B090905003 and 2019A0102006), av Department of Science and Technology i Guangzhou (Grant No. 202102020110), av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 till Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
