Summary
يصف هذا العمل بروتوكولا تجريبيا جديدا يستخدم حاملا مطبوعا ثلاثي الأبعاد لتمكين تصوير الخلايا الحية عالي الدقة للكرات الأرضية المنزوعة. من خلال هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة نشاط إشارات الكالسيوم الخلوية في ظهارة القرنية المصابة من الكرات الأرضية خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي.
Abstract
التئام الجروح الظهارية القرنية هو عملية هجرة تبدأ عن طريق تنشيط مستقبلات purinergic المعبر عنها على الخلايا الظهارية. ينتج عن هذا التنشيط أحداث تعبئة الكالسيوم التي تنتشر من خلية إلى أخرى ، وهي ضرورية لبدء الحركة الخلوية في سرير الجرح ، مما يعزز التئام الجروح بكفاءة. طور مختبر Trinkaus-Randall منهجية لتصوير استجابة التئام جروح القرنية في كرات الفئران خارج الجسم الحي في الوقت الفعلي. يتضمن هذا النهج استئصال كرة أرضية سليمة من فأر تم قتله رحيما وفقا للبروتوكولات المعمول بها واحتضان الكرة الأرضية على الفور بصبغة مؤشر الكالسيوم. يمكن تطبيق صبغة مضادة تلطخ الميزات الأخرى للخلية في هذه المرحلة للمساعدة في التصوير وإظهار المعالم الخلوية. عمل البروتوكول بشكل جيد مع العديد من أصباغ الخلايا الحية المختلفة المستخدمة في مكافحة التلطيخ ، بما في ذلك الأكتين SiR لتلطيخ الأكتين وصبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة لتلطيخ غشاء الخلية. لفحص الاستجابة للجرح ، يتم إصابة ظهارة القرنية باستخدام إبرة 25 G ، ويتم وضع الكرات الأرضية في حامل مطبوع 3D. تتم معايرة أبعاد حامل الطباعة 3D لضمان تجميد الكرة الأرضية طوال مدة التجربة ويمكن تعديلها لاستيعاب العيون ذات الأحجام المختلفة. يتم إجراء التصوير بالخلايا الحية لاستجابة الجرح بشكل مستمر على أعماق مختلفة في جميع أنحاء الأنسجة بمرور الوقت باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يسمح لنا هذا البروتوكول بإنشاء صور عالية الدقة وجودة النشر باستخدام هدف هوائي 20x على مجهر متحد البؤر. يمكن أيضا استخدام أهداف أخرى لهذا البروتوكول. وهو يمثل تحسنا كبيرا في جودة تصوير الخلايا الحية في كرات الفئران خارج الجسم الحي ويسمح بتحديد الأعصاب والظهارة.
Introduction
القرنيه
القرنية عبارة عن بنية شفافة غير وعائية تغطي السطح الأمامي للعين والتي تنكسر الضوء لتمكين الرؤية وتحمي الجزء الداخلي من العين من التلف. نظرا لأن القرنية تتعرض للبيئة ، فهي عرضة للتلف من الأسباب الميكانيكية (الخدش) ومن العدوى. عادة ما تلتئم إصابة القرنية في مريض سليم في غضون 1-3 أيام. ومع ذلك ، في المرضى الذين يعانون من حالات كامنة بما في ذلك نقص الخلايا الجذعية الحوفية ومرض السكري من النوع الثاني ، يمكن أن تطول عملية التئام جروح القرنيةبشكل كبير 1. نظرا لأن القرنية معصبة للغاية ، فإن قرح القرنية غير الشافية وتآكل القرنية المتكرر مؤلمة للغاية وتقلل بشكل كبير من نوعية حياة المرضى الذين يعانون منها1.
إشارات الخلية
عندما تصاب قرنية سليمة ، تسبق أحداث إشارات الكالسيوم في الخلايا المجاورة للجرح وتدفع الهجرة الخلوية إلى سرير الجرح ، حيث تغلق الإصابة دون التعرض لخطر التندب 2,3. تم وصف أحداث الإشارات هذه بشكل جيد في نماذج زراعة الخلايا الظهارية للقرنية باستخدام تصوير الخلايا الحية2. تظهر التجارب الأولية إشارات الكالسيوم بشكل ملحوظ بعد الإصابة في الخلايا غير المصابة بالسكري مقارنة بخلايا السكري. ومع ذلك ، فقد ثبت أن توصيف أحداث إشارات الخلية في الكرات الأرضية خارج الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا.
تصوير الخلايا الحية
نجحت الدراسات السابقة في تسجيل أحداث إشارات الكالسيوم من نماذج زراعة الخلايا في المختبر لالتئام جروح القرنية4،5،6. إن تطوير منهجية لإنتاج صور عالية الجودة لأحداث الإشارات هذه في الأنسجة خارج الجسم الحي أمر مهم للغاية لأنه سيسمح بدراسة هذه الأحداث في نظام أكثر تعقيدا وواقعية. تضمنت الأساليب السابقة تشريح القرنية متبوعا بالشلل في جل PEGالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية 7،8،9. يعد التثبيت خطوة أساسية ولكنها صعبة عند العمل مع الأنسجة الحية ، حيث يجب أن تظل قابلة للحياة ورطبة طوال فترة التجربة. علاوة على ذلك ، يجب ألا يؤدي الشلل إلى إتلاف الأنسجة. في حين أن حل PEG يجمد الأنسجة ، إلا أن دقة وجودة الصور المنتجة لم تكن متسقة. لذلك ، تم تطوير حوامل مطبوعة 3D لشل حركة الكرات الأرضية السليمة لإنتاج صور عالية الجودة مع مخاطر أقل لتلف الأنسجة.
النهج المتبع
تم تطوير حامل مطبوع 3D فريد من نوعه لشل حركة الكرات الأرضية خارج الجسم الحي لتصوير الخلايا الحية. يمنع هذا الحامل الضرر من مصدرين رئيسيين: فهو يسمح بتصوير الكرة الأرضية المنزوعة النواة دون الحاجة إلى تشريح القرنية ، ويزيل التعرض للأشعة فوق البنفسجية. بدون مصادر الضرر هذه ، مثلت الصور التي تم الحصول عليها بدقة أكبر الاستجابة لإصابات الخدش التي تم إجراؤها تجريبيا. علاوة على ذلك ، تمت معايرة حامل الطباعة 3D إلى الأبعاد الدقيقة لعين الفأر. قدم هذا ملاءمة أفضل بكثير من الشلل في محلول PEG ، مما أدى إلى صورة عالية الجودة في أهداف أقل طاقة بسبب انخفاض حركة الأنسجة. يضمن قضيب الغطاء المتصل بالجزء العلوي من الحامل بقاء الكرة الأرضية غير متحركة طوال مدة التجربة وعدم وجود إزاحة للكرة الأرضية عند تطبيق وسائط النمو للحفاظ على الترطيب والحيوية. تتيح لنا القدرة على طباعة الحامل بأبعاد دقيقة أيضا إنشاء ملاءمة مثالية لعيون الفئران ذات الأحجام المختلفة بسبب العمر أو حالة المرض. يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا على نطاق أوسع لتطوير حوامل لعيون الأنواع المختلفة بناء على أبعادها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في رعاية العيون وأبحاث الرؤية وبروتوكول IACUC بجامعة بوسطن (201800302).
1. تصميم أصحاب المطبوعة 3D وشريط الغطاء
- تصميم حوامل الطباعة ثلاثية الأبعاد وشريط الغطاء الذي يمثل متوسط قطر كرات الماوس وطباعة التصميم ثلاثي الأبعاد (الشكل 1 أ ، ب).
- حافظ على قطر الجدار الداخلي للحامل أكبر قليلا من متوسط قطر الكرة الأرضية لحساب الأحجام المختلفة للفئران الفردية. حافظ على ارتفاع الحامل عند حوالي نصف قطر الكرة الأرضية ، مما يضمن ملاءمة محكمة للكرة الأرضية عند تأمينها بواسطة شريط الغطاء المطبوع 3D.
- قم بقياس قضيب غطاء الحامل بطول القطر الخارجي للحامل بعرض يتراوح من 1/4 إلى 1/2 من قطر الحامل. تم تحديد حجم قضيب الغطاء للسماح بالوصول إلى الكرة الأرضية عند تثبيته في الحامل للترطيب وإزالة العين في نهاية التجربة.
- اطبع الحامل وشريط الغطاء.
2. جمع العينات
- تم استخدام فئران القتل الرحيم (ذكور C57BL / 6 فئران تتراوح أعمارهم بين 9-12 أسبوعا و 27 أسبوعا في هذه الدراسة) باستخدام البروتوكولات المعمول بها وفقا للإرشادات المؤسسية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإجراء القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون متبوعا بقطع الرأس.
- قم بإزالة رأس الماوس وضعه على الفور على الثلج للحفاظ على صلاحية الأنسجة. قم باستئصال الكرات الأرضية باستخدام أدوات التشريح مع منع تلف الأنسجة.
- بروتينوز الكرة الأرضية باستخدام ملاقط. قص العصب البصري باستخدام مقص تشريح أسفل المكان الذي تمسكه به الملقط.
ملاحظة: لمزيد من الاحتياطات ، قم بتنفيذ الخطوات التالية في غطاء التدفق الرقائقي. - احتضان الكرات الأرضية في 2 مل من الوسط في طبق زراعة الخلايا p35 بما في ذلك مؤشر الكالسيوم و / أو صبغة غشاء الخلية لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 مع ظروف الإضاءة المنخفضة. تأكد من غمر الكرات الأرضية في وسط التلوين لتلطيخ موحد.
- بالنسبة للتجارب التي أجريت هنا ، استخدم مؤشر الكالسيوم ، Fluo4-AM (1: 100) 2 ، وصبغة مضادة غشاء الخلية ، صبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة (1: 10000) 2 ، بتركيز نهائي 1٪ (v / v) DMSO و 0.1٪ (وزن / حجم) حمض بلورونيك في 2 مل من وسط مصل الخلايا الكيراتينية الخالي (KSFM) مع مكملات النمو التالية: 25 ميكروغرام / مل مستخلص الغدة النخامية البقري ، 0.02 نانومتر عامل نمو البشرة ، 0.3 mM CaCl2 ، والبنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي).
ملاحظة: تختلف ظروف وأوقات الحضانة اعتمادا على مؤشر الكالسيوم ونوع الأنسجة وحجم العينة. عند استخدام حمض pluronic ، ينصح بالحذر لأنه يجعل الأنسجة قابلة للنفاذ. يدعو هذا البروتوكول إلى 10٪ حمض بلورونيك. تم تحديد تركيزات أقل من حمض pluronic تجريبيا لتكون غير فعالة ، والتركيزات الأعلى خطر تلف الأنسجة.
- بالنسبة للتجارب التي أجريت هنا ، استخدم مؤشر الكالسيوم ، Fluo4-AM (1: 100) 2 ، وصبغة مضادة غشاء الخلية ، صبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة (1: 10000) 2 ، بتركيز نهائي 1٪ (v / v) DMSO و 0.1٪ (وزن / حجم) حمض بلورونيك في 2 مل من وسط مصل الخلايا الكيراتينية الخالي (KSFM) مع مكملات النمو التالية: 25 ميكروغرام / مل مستخلص الغدة النخامية البقري ، 0.02 نانومتر عامل نمو البشرة ، 0.3 mM CaCl2 ، والبنسلين الستربتومايسين (100 وحدة / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي).
3. إعداد حاملي العينات
- قم بلصق الحوامل على غطاء زجاجي نظيف مع غراء لم يتم استخدامه من قبل. يأتي الغراء المستخدم في هذا البروتوكول من حاويات تستخدم مرة واحدة لضمان العقم ويتم استخدام حاوية جديدة غير مفتوحة في كل مرة.
- اغسل الحامل بنسبة 70٪ إيثانول. ضع الغراء على الحامل وألصق الحامل بغطاء الغطاء السفلي الزجاجي. تأكد من عدم وجود غراء داخل المنطقة الداخلية للحامل لأن الغراء يمكن أن يتألق ، مما يعقد التصوير.
- انتظر حتى يصلب الغراء. تأكد من أن الحامل محكم ضد قسيمة الغطاء.
ملاحظة: تم استخدام ألواح الخلايا P35 ذات أغطية ذات قاع زجاجي للتجارب المعروضة في هذه المخطوطة. يمكن استبدال الشرائح و / أو الألواح الأخرى ذات القاع الزجاجي بناء على احتياجات التجربة.
4. جرح كرات العين
- قم بإزالة الكرات الأرضية من محلول التلوين باستخدام قطارات العين المعقمة ، مع الحرص على منع تلف الأنسجة في المنطقة محل الاهتمام. اغسل الكرات الأرضية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات لإزالة البقع الزائدة ، وضع الكرات الأرضية في الوسط لنقلها إلى المجهر.
- جرح الكرات الأرضية باستخدام إبرة معقمة 25 غرام في المنطقة محل الاهتمام.
- باستخدام قطارة العين المعقمة ، التقط الكرة الأرضية وأمسك بها من مؤخرة العين. سيؤدي ذلك إلى الحفاظ على استقرار الكرة الأرضية ، ومنعها من التدحرج ، والسماح بعمل جروح ثابتة. باستخدام هذا الإعداد ، سيكون العصب البصري داخل فوهة قطارة العين ، وستكون القرنية متجهة للخارج.
- لجرح الخدش ، حرك إبرة معقمة برفق 25 جم عبر القرنية المكشوفة. لجرح ثقب ، اضغط برفق على الإبرة مباشرة في القرنية المركزية. تأكد من أن الجرح لا يثقب القرنية.
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا لم تكن استجابة الجرح أو البيئة الجريحة مطلوبة للتجربة. أظهرت الدراسات السابقة أن كلا من جروح الخدش وجروح البزل في قرنية الفئران المصنوعة باستخدام هذه الطريقة متسقة في كل من القطر والعمق10. تم تأكيد أبعاد الجرح بين الكرات الأرضية المستقلة باستخدام تحليل منطقة الاهتمام.
5. وضع العينة على حامل
- ضع القرنية أو منطقة القزحية على غطاء الغطاء في المنطقة الداخلية للحامل وثبت باستخدام الغطاء المطبوع 3D (الشكل 1C-H).
- تأكد من وضع الكرة الأرضية بشكل صحيح وأن موقع الاهتمام ملامس لغطاء الغطاء الزجاجي. بمجرد وضع الكرة الأرضية في الحامل ، لا تحاول إزالة الكرة الأرضية لأن ذلك قد يتسبب في تلف الأنسجة.
- التمسك غطاء مطبوع 3D لحامل باستخدام الغراء، وضمان الاستقرار. تأكد من أن شريط الغطاء يلتصق بالحامل وليس بالكرة الأرضية.
ملاحظة: يتم وضع المنطقة المراد تصويرها لأسفل لأن البروتوكول مكتوب للاستخدام على مجهر مقلوب. يمكن تكييف البروتوكول مع المجاهر المستقيمة باستخدام حوامل ذات نصف قطر داخلي أصغر وإزالة شريط الغطاء. سيؤدي هذا إلى استقرار أقل للكرة الأرضية.
6. تصوير العينة
- قم بتشغيل المجهر والغرفة البيئية وتحقق من ترطيب الغرفة. اضبط الغرفة البيئية على 35 درجة مئوية و 5٪ CO2 طوال مدة التجربة.
ملاحظة: يفضل استخدام المجاهر ذات الغرف البيئية لهذا الإجراء لمنع الجفاف والحفاظ على الكرة الأرضية في درجات حرارة مثالية ولكنها غير مطلوبة. - ضع الغطاء والحامل والكرة الأرضية المستقرة على مسرح المجهر داخل الغرفة البيئية والصورة باستخدام تقنيات التصوير بالخلايا الحية9.
- ماصة وسائط نمو إضافية على غطاء الغطاء لمنع الجفاف والحفاظ على صلاحية الأنسجة. تأكد من وجود وسيط كاف في البئر لتغطية الكرة الأرضية في الحامل. اعتمادا على مدة التصوير ، أضف وسيطا جديدا عند الحاجة طوال التجربة.
- ابدأ التجارب باستخدام تقنيات وبروتوكولات التصوير بالخلايا الحية. استخدم إعدادات الليزر منخفضة الطاقة للحفاظ على الأنسجة ومنع تلف الأنسجة في التجارب طويلة الأمد. استخدم الأهداف المناسبة لمسافات العمل الطويلة. أجريت التجارب في هذه المخطوطة باستخدام هدف 20x.
ملاحظة: قوة الليزر وكسبه ، والمدة التجريبية ، والموقع ، ومستوى التصوير كلها متغيرات اعتمادا على المعلمات التجريبية. تم إجراء تجارب التصوير على الكرات الأرضية السليمة التي تتراوح مدتها من 1 ساعة إلى 4 ساعات بنجاح في المنشورات السابقة10. - تسجيل وحفظ البيانات بتنسيق الملف المفضل. ينتج البرنامج الذي يستخدمه المجهر ملفات .czi لتسجيل البيانات.
- تخلص من الكرات الأرضية وفقا للبروتوكولات المؤسسية القياسية في نهاية البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام هذا البروتوكول لإنتاج بيانات وصور بجودة النشرباستمرار 10. تمثل الصور التي تم الحصول عليها تحسنا كبيرا عند مقارنتها بالنهج السابقة (الشكل 2). باستخدام حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد ، يمكن التقاط الصور في جميع أنحاء طبقات القرنية ، ويمكن ملاحظة تعبئة الكالسيوم في مستويات z المختلفة (الشكل 3). تم استخدام هذا النهج لمقارنة إشارات الخلية الخلوية بين طبقات الخلايا القمية والقاعدية عند الجرح في الفئران الصغيرة والكبيرة10.
كما سمح الاستقرار المحسن بتصوير الكرات الأرضية لفترة أطول بكثير مما كان ممكنا في السابق. وقد سمح ذلك بتمديد دراسات الهجرة الخلوية إلى سرير الجرح لعدة ساعات تتجاوز القدرات السابقة. مع هذا الجدول الزمني الممتد ، يمكن ملاحظة اختلافات كبيرة في السلوك الخلوي أثناء استجابة التئام الجروح بين الفئران الصغيرة والكبيرة بعد إصابة القرنية10. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم جمع البيانات كل 5 دقائق لمدة 4 ساعات. عند استخدام الحامل ، لم يلاحظ أي انحراف كبير في المستويات x أو y أو z طوال فترة التجربة (الشكل 4 ، الفيديو 1).
ميزة هذا البروتوكول هو أنه يسمح بتصوير مناطق مختلفة من القرنية بناء على وضع الكرة الأرضية في الحامل. في منشور حديث ، تم الاستفادة من هذه الميزة لجمع الصور في كل من القرنية المركزية وفي منطقة القرنية والأطراف (الشكل 5)10. تم العثور على إصابة في القرنية المركزية لإنتاج أحداث إشارات الكالسيوم في الخلايا المجاورة للأعصاب في منطقة القزحية10. يتجاوز تعدد استخدامات الحامل تثبيت الكرة الأرضية لتجارب التصوير وقد تم استخدامه في العديد من التطبيقات المختلفة. من خلال وضع القرنية ووجهها لأعلى في الحامل ، تم إجراء تجارب المسافة البادئة النانوية لقياس صلابة ظهارة القرنية والغشاء القاعدي والسدى في الفئران الصغيرة والكبيرة10,11.
الشكل 1: مخططات وإعداد حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد. (أ) تصميم الحامل المطبوع ثلاثي الأبعاد بأبعاد ارتفاع وعرض مشروحة. (ب) صورة ملف CAD تمثيلية من برنامج طابعة 3D. (ج) صورة تمثيلية لحامل الحامل مع غطاء مرفق يحتوي على كرة أرضية من الفئران. (د) يتم تطبيق الغراء المعقم الذي يستخدم مرة واحدة على الجزء السفلي من حامل 3D المطبوعة. (ه) يتم لصق حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد بطبق زراعة الخلايا p35 ذو القاع الزجاجي. (ه) توضع كرة أرضية منزوعة النواة في الحامل باستخدام قطارة عين معقمة. (G) يتم لصق شريط الغطاء بالجزء العلوي من حامل الطباعة 3D لضمان تثبيت الكرة الأرضية. (H) يتم وضع الصفيحة ذات القاع الزجاجي مع حامل ملتصق وكرة أرضية على مسرح المجهر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: استخدام حوامل مطبوعة 3D متخصصة لتثبيت الكرة الأرضية وإنتاج بيانات تصوير عالية الجودة للهياكل متعددة الطبقات . (A) و (B) يمثلان بيانات التصوير الحية النموذجية للقرنية المصابة خارج الجسم الحي المستقرة بدون ومع حامل مطبوع 3D ، على التوالي. يمكن تحديد أحداث إشارات الكالسيوم (الخضراء) والخلايا المضادة (صبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة) بوضوح في الطبقات القمية والقاعدية واللحمية للقرنية في (B) ولكن ليس في (A). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: Z-stack من القرنية يجمد في حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد. صور تمثيلية لمكدس z تم التقاطه من خلال طبقات القرنية عند جرح خدش (يشار إليه بعلامة النجمة البيضاء). العينة ملطخة بصبغة غشاء بلازما حمراء عميقة لتصور أغشية الخلايا و Fluo4-AM (أخضر) لتصور إشارات الكالسيوم. أ: يمكن رؤية طبقة الخلية القمية، ب: الخلايا القمية والقاعدية، ج: طبقة الخلايا القاعدية، د: السدى في طبقة الجرح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تجربة سلسلة زمنية تمثيلية مدتها 4 ساعات لقرنية تكشف عن حركة صغيرة للكرة الأرضية في الاتجاهات x أو y أو z. الصورة لإصابة جرح خدش (يشار إليها بعلامة النجمة البيضاء) في القرنية المركزية لكرة أرضية خارج الجسم الحي. الكرة الأرضية ملطخة بصبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة لتصور أغشية الخلايا و Fluo4-AM (الأخضر) لتصور أحداث إشارات الكالسيوم. يتم تجميد الكرة الأرضية باستخدام حامل مطبوع 3D. تم التقاط الصور على بعد 1 ساعة ، بدءا من 5 دقائق بعد الإصابة. لوحظ انحراف صغير في اتجاهات x أو y أو z باستخدام إعداد التصوير هذا طوال فترة التجربة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: رسم تخطيطي لمواقع التصوير على كرة أرضية سليمة. يسمح حامل الطباعة 3D بتصوير كرة أرضية سليمة خارج الجسم الحي في مواقع مختلفة. تم استخدام الحامل لجمع الصور من كل من المناطق المركزية والقوفية للقرنية. الكرات ملطخة بصبغة غشاء بلازما حمراء عميقة للكشف عن أغشية الخلايا و Fluo4-AM (أخضر) للكشف عن إشارات الكالسيوم. (أ) صورة تمثيلية للقرنية المركزية عند جرح خدش. (ب) صورة تمثيلية للمنطقة القوفية للقرنية بعد إصابة القرنية المركزية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فيديو 1: فيلم لكرة أرضية مثبتة في حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد لمدة 4 ساعات. تم تجميد الكرة الأرضية باستخدام حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد وملطخة بصبغة غشاء بلازما حمراء عميقة (حمراء) لتصور أغشية الخلايا و Fluo4-AM (أخضر) لتصور أحداث إشارات الكالسيوم. تم التقاط صورة كل 5 دقائق لمدة 4 ساعات ، تبدأ بعد 5 دقائق من الإصابة. لوحظ انحراف صغير في اتجاهات x أو y أو z باستخدام إعداد التصوير هذا طوال فترة التجربة. سرعة التشغيل 30 إطارا في الثانية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير الخلايا الحية التي تستخدم حامل مطبوع 3D لتثبيت وتثبيت عيون الحيوانات السليمة. إنه مصمم للتحايل على العديد من العيوب المهمة المعترف بها مع بروتوكولات تصوير الخلايا الحية السابقة لأنسجة القرنية خارج الجسم الحي . يوفر هذا البروتوكول العديد من المزايا لتصوير الخلايا الحية للكرات الأرضية السليمة. يقلل بشكل كبير من تلف الأنسجة غير الضروري الذي يمكن أن يتداخل مع استجابة التئام الجروح لجروح الخدش المستحثة تجريبيا. وهذا يشمل تلف الأعصاب والظهارة من التشريح والتعرض للأشعة فوق البنفسجية. علاوة على ذلك ، يسهل هذا البروتوكول ترطيب الأنسجة وصلاحيتها عن طريق شل حركة الأنسجة بطريقة تسمح بتطبيق وسط النمو بشكل دوري دون تعطيل التجارب. من خلال تغيير اتجاه العين في الحامل ، يسمح البروتوكول بتصوير مناطق مختلفة على الكرة الأرضية. يسمح استخدام الفحص المجهري متحد البؤر جنبا إلى جنب مع هذا البروتوكول بتصوير مستويات مختلفة من الكرة الأرضية ، مما يسمح بمراقبة التفاعلات بين هياكل الأنسجة. البروتوكول متعدد الاستخدامات للغاية ويمكن تكييفه مع الكرات الأرضية ذات الأحجام المختلفة من الفئران والأنواع الأخرى. يمكن إزالة الحوامل والأغطية بسهولة من آبار التصوير وتعقيمها وإعادة استخدامها. بروتوكول الطباعة 3D فعال وفعال من حيث الوقت ، مما يسمح بإنشاء مريح للعديد من حاملي في وقت واحد. يمكن تثبيت الكرات الأرضية داخل الحوامل إذا كانت هناك حاجة إلى الاحتفاظ بالعينات وتصويرها مرة أخرى في وقت لاحق. تحتفظ الأنسجة الثابتة بصبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة وبقع Fluo4-AM لعدة أسابيع بعد التثبيت ، والتي يمكن استخدامها كعلامات عند تلطيخ بروتين (بروتينات) معين.
دعت البروتوكولات السابقة إلى تشريح العين والاستخدام اللاحق لجل PEG المنشط بالأشعة فوق البنفسجية لشل حركة القرنية لتصوير7،8،9. الأضرار التي لحقت الأنسجة التي لحقت من خلال هذه التقنيات يمكن أن تربك النتائج التجريبية. هذا مهم بشكل خاص في الاعتبار عند دراسة العمليات الخلوية والأنسجة التي ينطوي عليها التئام الجروح ، لأن هذا الضرر الإضافي الذي يتجاوز الجروح المطبقة تجريبيا قد يغير استجابة التئام الجروح 4,12. ستتأثر مدخلات أعصاب القرنية الحسية بالبروتوكول السابق ، حيث تقطع عملية التشريح الأعصاب عن أجسامها الخلوية في العقدة ثلاثية التوائم13. علاوة على ذلك ، فإن تشريح القرنية في حد ذاته يؤدي إلى استجابة للإصابة ، حيث أن العوامل القابلة للذوبان المنبعثة من الإصابة هي المسؤولة عن استجابة التئام الجروح4. يعالج هذا الإجراء الجديد نقاط الضعف هذه عن طريق تصوير الكرات الأرضية سليمة. باستخدام هذه المنهجية ، يقتصر الضرر الذي يلحق بالعين على قطع العصب البصري عند الاستئصال ويحافظ على بقاء الخلية داخل القرنية لفترات طويلة من الزمن. معا ، تخلق هذه التحسينات محاكاة أفضل لاستجابة الجرح.
يعد التثبيت خطوة أساسية ولكنها صعبة عند العمل مع الأنسجة الحية ، حيث يجب أن تظل قابلة للحياة ورطبة طوال فترة التجربة. بينما يمكن تأمين القرنيات والكرات الأرضية باستخدام جل PEG الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ، فإن الإجراء يتطلب تشعيعا بالأشعة فوق البنفسجية بعد وضع الأنسجة في الحامل8. لوحظ أن التشعيع المطلوب لبلمرة PEG يقلل من الاستجابة الخلوية. علاوة على ذلك ، قلل PEG من دقة الصور ، وكانت وظيفة AiryScan مطلوبة لمراقبة إشارات الخلية. في هذا البروتوكول الجديد ، تم تحسين أبعاد الحامل لتناسب الكرات الأرضية بدقة ، ويوفر شريط الغطاء طبقة إضافية من التثبيت. يلغي الحامل وقضيب الغطاء الحاجة إلى استخدام PEG ، الذي ينتج صورا عالية الجودة وعالية الدقة مع لقطات في الوقت الفعلي لعملية التئام الجروح. يتمثل أحد الحلول للمشكلات المذكورة أعلاه في التخلي عن تصوير الخلايا الحية تماما وإصلاح الكرات الأرضية في بارافورمالدهيد (4٪) في أوقات محددة مسبقا بعد الإصابة. ومع ذلك ، مع الأنسجة الثابتة ، لا يمكن ملاحظة العمليات الخلوية المستمرة مثل إشارات الكالسيوم وآثار هذه العمليات على التغيرات الجسدية في الأنسجة. بالنسبة للمجموعات المهتمة بتسجيل وقياس أحداث الاتصال بين الخلايا في ظهارة القرنية ، فإن الحدود التي يفرضها تثبيت الأنسجة تجعل هذه التقنية غير عملية لهذه الأغراض.
يحتوي هذا البروتوكول الجديد على خطوتين رئيسيتين: (1) القتل الرحيم والاستئصال الفوري للكرة الأرضية ، و (2) وضع وتوجيه الكرة الأرضية داخل الحامل. يجب إجراء قطع العصب البصري واستئصال الكرة الأرضية بعناية عن طريق دعامة العين دون وضع دعامة للحفاظ على الهياكل الداخلية والخارجية. يعد تحديد المواقع والتوجيه ضروريين لتصوير المواقع ذات الأهمية وضمان التركيز على أكبر مجال رؤية ممكن بتفاصيل كافية. من الضروري وضع الكرة الأرضية بشكل صحيح قبل وضع قضيب الغطاء على الحامل.
يمكن تعديل العديد من متغيرات البروتوكول اعتمادا على متطلبات المعلمات التجريبية. يمكن طباعة الحوامل بأحجام مختلفة لاستيعاب الكرات الأرضية ذات الأحجام المختلفة. تظل المعلمات المتعلقة بقطر الحامل وارتفاعه بالنسبة لحجم الكرة الأرضية كما هي عبر نطاقات الحجم. إذا واجه المستخدم الانجراف في المستوى z ، فقد يكون السبب المحتمل هو أن الأنسجة غير ثابتة ، ويجب إعادة تصنيع الحامل. يمكن تعديل تلطيخ الكرات الأرضية السليمة اعتمادا على المعلمات التجريبية والبقع المستخدمة والبيئة المثلى والتركيزات للأنسجة ذات الاهتمام. يمكن تعديل المدة التجريبية طالما تم الحفاظ على صلاحية الأنسجة. تم إجراء تجارب قصيرة الأجل تتضمن 1 ساعة من التصوير المستمر للأنسجة وتجارب طويلة الأجل تتضمن تصوير الأنسجة على فترات منتظمة على مدار 4 ساعات بنجاح. تم إجراء هذه التجارب على مجهر مقلوب ، وتم تصميم هذا البروتوكول للاستخدام الأمثل مع إعداد تصوير مماثل. بمجرد استقرار الكرة الأرضية ووضعها داخل الحامل ، يمكن أن تؤدي إزالة الكرة الأرضية إلى تلف الأنسجة. وبالتالي ، فإن تحديد المواقع والاتجاه الأمثل للكرة الأرضية قبل توصيل شريط الغطاء ضروريان. يمكن تثبيت الكرات الأرضية في 4٪ بارافورمالدهيد بينما لا تزال داخل الحوامل لمزيد من التحليل لتوطين البروتين. أظهرت البيانات الأولية أن صبغة غشاء البلازما الحمراء العميقة وتلطيخ Fluo4-AM يتم الاحتفاظ بها من خلال عملية التثبيت.
على الرغم من أن هذا البروتوكول له العديد من المزايا مقارنة بالبروتوكولات السابقة ، إلا أن هناك بعض القيود على هذا النهج التجريبي. عيب واحد هو أنه من الصعب إزالة الكرة الأرضية من الحامل دون الإضرار بظهارة القرنية. وبالتالي ، يجب تثبيت الكرة الأرضية في الحامل لإعادة التصوير باستخدام طرق توطين البروتين أو الحمض النووي الريبي في وقت لاحق. هذا يمكن أن يحد من دراسات المتابعة. عيب آخر لهذا البروتوكول أثناء بروتوكولات التصوير لفترات طويلة هو أنه يجب الحفاظ على الماء. تتطلب الحاجة إلى إعادة تطبيق الوسائط يدويا على فترات منتظمة أن يراقب شخص ما بنشاط عملية التصوير لمدى التجربة. قد يكون هذا تحديا لوجستيا لبروتوكولات التصوير الموسعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
نود أن نعترف بالمعاهد الوطنية للصحة لدعم المنح التالية: RO1EY032079 (VTR) و R21EY029097-01 (VTR) و 1F30EY033647-01 (KS) و 5T32GM008541-24 (KS). نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لصندوق ماساتشوستس ليونز لأبحاث العيون وصندوق نيو إنجلاند لزراعة القرنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
