Summary
Det nuværende arbejde beskriver en ny eksperimentel protokol, der bruger en 3D-trykt holder til at muliggøre højopløsnings levende cellebilleddannelse af enukleerede kloder. Gennem denne protokol kan den cellulære calciumsignalaktivitet i såret hornhindeepitel fra ex vivo-kloder observeres i realtid.
Abstract
Hornhindepitelsårheling er en migrationsproces initieret ved aktivering af purinerge receptorer udtrykt på epitelceller. Denne aktivering resulterer i calciummobiliseringshændelser, der forplanter sig fra celle til celle, som er afgørende for at initiere cellulær bevægelighed i sårlejet og fremme effektiv sårheling. Trinkaus-Randall-laboratoriet har udviklet en metode til billeddannelse af hornhindesårhelingsresponsen i ex vivo murine glober i realtid. Denne tilgang indebærer at enukleere en intakt klode fra en mus, der er blevet aflivet i henhold til etablerede protokoller og straks inkubere kloden med et calciumindikatorfarvestof. En modfarve, der pletter andre funktioner i cellen, kan anvendes på dette stadium for at hjælpe med billeddannelse og vise cellulære vartegn. Protokollen fungerede godt med flere forskellige levende cellefarvestoffer, der blev brugt til modfarvning, herunder SiR actin til at plette actin og dyb rød plasmamembranplet til at plette cellemembranen. For at undersøge reaktionen på et sår skades hornhindeepitelet ved hjælp af en 25 G-nål, og kuglerne placeres i en 3D-trykt holder. Dimensionerne på den 3D-printede holder er kalibreret for at sikre immobilisering af kloden i hele eksperimentets varighed og kan ændres til at rumme øjne i forskellige størrelser. Levende cellebilleddannelse af sårresponsen udføres kontinuerligt på forskellige dybder i hele vævet over tid ved hjælp af konfokal mikroskopi. Denne protokol giver os mulighed for at generere billeder i høj opløsning i publikationskvalitet ved hjælp af et 20x luftmål på et konfokalmikroskop. Andre mål kan også bruges til denne protokol. Det repræsenterer en betydelig forbedring af kvaliteten af levende cellebilleddannelse i ex vivo murine glober og gør det muligt at identificere nerver og epitel.
Introduction
Hornhinde
Hornhinden er en klar, avaskulær struktur, der dækker øjets forreste overflade, der bryder lys for at muliggøre syn og beskytter det indre af øjet mod skader. Da hornhinden udsættes for miljøet, er den modtagelig for skader fra både mekaniske årsager (ridser) og fra infektion. En hornhindeskade hos en ellers sund patient heler typisk inden for 1-3 dage. Hos patienter med underliggende tilstande, herunder limbal stamcellemangel og type II-diabetes, kan hornhindesårhelingsprocessen imidlertid forlænges meget1. Da hornhinden er meget innerveret, er disse ikke-helbredende hornhindesår og tilbagevendende hornhindeerosioner meget smertefulde og mindsker i høj grad livskvaliteten for patienter, der oplever dem1.
Celle signalering
Når en ellers sund hornhinde er skadet, går calciumsignaleringshændelser i cellerne ved siden af såret forud og beder cellulær migration ind i sårlejet, hvor de lukker skaden uden risiko for ardannelse 2,3. Disse signalhændelser er blevet godt karakteriseret i hornhindepitelcellekulturmodeller ved hjælp af levende cellebilleddannelse2. Foreløbige forsøg viser signifikant mere calciumsignalering efter skade i ikke-diabetiske celler sammenlignet med diabetiske celler. Karakterisering af cellesignaleringshændelserne i ex vivo-kloder har imidlertid vist sig at være en teknisk udfordring.
Billeddannelse af levende celler
Tidligere undersøgelser har med succes registreret calciumsignaleringshændelser fra in vitro-cellekulturmodeller af hornhindesårheling 4,5,6. Udvikling af en metode til fremstilling af billeder af høj kvalitet af disse signalhændelser i ex vivo-væv er af stor interesse, fordi det ville gøre det muligt at studere disse begivenheder i et mere komplekst og virkelighedstro system. Tidligere tilgange har involveret dissektion af hornhinden efterfulgt af immobilisering i en UV-induceret PEG-gel 7,8,9. Immobilisering er et vigtigt, men udfordrende trin, når man arbejder med levende væv, da det skal forblive levedygtigt og hydreret i løbet af eksperimentet. Desuden må immobilisering ikke beskadige vævet. Mens PEG-løsningen immobiliserede vævet, var opløsningen og kvaliteten af de producerede billeder ikke konsistent. Derfor blev 3D-printede holdere udviklet til at immobilisere intakte kloder for at producere billeder af højere kvalitet med mindre risiko for vævsskade.
Tilgangen
En unik 3D-printet holder blev udviklet til at immobilisere intakte ex vivo-kloder til levende cellebilleddannelse. Denne holder forhindrer skader fra to hovedkilder: det giver mulighed for billeddannelse af en enukleeret klode uden behov for at dissekere hornhinden, og det eliminerer udsættelse for UV-lys. Uden disse skadekilder repræsenterede de opnåede billeder mere præcist reaktionen på de ridseskader, der blev foretaget eksperimentelt. Desuden blev den 3D-printede holder kalibreret til murineøjets præcise dimensioner. Dette gav en meget bedre pasform end immobilisering i PEG-løsning, hvilket førte til et billede af højere kvalitet ved lavere drevne mål på grund af nedsat vævsbevægelse. En dækstang, der er fastgjort til toppen af holderen, sikrer, at kloden forbliver ubevægelig i hele eksperimentets varighed, og at der ikke er nogen forskydning af kloden, når vækstmedier påføres for at opretholde hydrering og levedygtighed. Evnen til at udskrive holderen til præcise dimensioner giver os også mulighed for at generere en optimal pasform til murine øjne i forskellige størrelser på grund af alder eller sygdomsstatus. Denne teknologi kan anvendes mere bredt til at udvikle holdere til forskellige arters øjne baseret på deres dimensioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerne, der involverede dyreforsøgspersoner, blev godkendt af Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research og Boston University IACUC protocol (201800302).
1. Design af 3D-printede holdere og dækbjælke
- Design de 3D-printede holdere og dækbjælken, der tegner sig for den gennemsnitlige diameter af musekugler, og 3D-print designet (figur 1A, B).
- Hold diameteren på holderens indre væg lidt større end klodens gennemsnitlige diameter for at tage højde for de forskellige størrelser af individuelle mus. Hold holderens højde på omkring halvdelen af globusdiameteren, hvilket sikrer en tæt pasform af kloden, når den sikres af den 3D-printede dækstang.
- Størrelse holderdækselen til længden af holderens ydre diameter med en bredde, der er 1/4 til 1/2 af holderens diameter. Dækstangen er dimensioneret til at give adgang til kloden, når den er fastgjort i holderen til hydrering og fjernelse af øjet ved afslutningen af eksperimentet.
- Udskriv holderen og dækbjælken.
2. Prøveindsamling
- Afliv mus (hanmus C57BL/6 i alderen 9-12 uger og 27 uger gamle blev brugt til denne undersøgelse) ved hjælp af etablerede protokoller i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer. For denne protokol skal du udføre eutanasi med kuldioxid efterfulgt af halshugning.
- Fjern musehovedet og læg det straks på is for at bevare vævets levedygtighed. Enukleer globerne ved hjælp af dissektionsværktøjer, mens du forhindrer vævsskade.
- Proptose kloden ved hjælp af pincet. Klip synsnerven ved hjælp af dissektionssaks lige under, hvor den holdes af pincetten.
BEMÆRK: For yderligere forholdsregler skal du udføre følgende trin i en laminær strømningshætte. - Der inkuberes globerne i 2 ml medium i en p35-cellekulturskål inklusive en calciumindikator og/eller cellemembranplet i 1 time i en 37 °C, 5 % CO2 -inkubator med lave lysforhold. Sørg for, at kuglerne er nedsænket i farvningsmediet for ensartet farvning.
- Til de eksperimenter, der udføres her, skal du bruge calciumindikatoren, Fluo4-AM (1:100)2, og cellemembranmodplet, dybrød plasmamembranplet (1:10.000)2, med en endelig koncentration på 1% (v/v) DMSO og 0,1% (w/v) plluronsyre i 2 ml keratinocytserumfrit medium (KSFM) med følgende væksttilskud: 25 μg/ml bovin hypofyseekstrakt, 0,02 nM epidermal vækstfaktor, 0,3 mM CaCl2, og penicillin-streptomycin (henholdsvis 100 enheder/ml og 100 μg/ml).
BEMÆRK: Inkubationsbetingelserne og tiderne varierer afhængigt af calciumindikatoren, vævstypen og prøvevolumenet. Ved anvendelse af plluronsyre tilrådes forsigtighed, da det gør væv gennemtrængeligt. Denne protokol kræver 10% pluronsyre. Lavere koncentrationer af pluronsyre er blevet bestemt eksperimentelt til at være ineffektive, og højere koncentrationer risikerer skade på vævet.
- Til de eksperimenter, der udføres her, skal du bruge calciumindikatoren, Fluo4-AM (1:100)2, og cellemembranmodplet, dybrød plasmamembranplet (1:10.000)2, med en endelig koncentration på 1% (v/v) DMSO og 0,1% (w/v) plluronsyre i 2 ml keratinocytserumfrit medium (KSFM) med følgende væksttilskud: 25 μg/ml bovin hypofyseekstrakt, 0,02 nM epidermal vækstfaktor, 0,3 mM CaCl2, og penicillin-streptomycin (henholdsvis 100 enheder/ml og 100 μg/ml).
3. Forberedelse af prøveindehavere
- Fastgør holderne til en ren glasbundsdæksel med lim, der ikke tidligere har været brugt. Limen, der bruges i denne protokol, kommer fra engangsbeholdere for at sikre sterilitet, og en ny, uåbnet beholder bruges hver gang.
- Holderen vaskes i 70% ethanol. Anbring lim på holderen, og fastgør holderen til glasbunddækslet. Sørg for, at der ikke er lim inden for holderens indre område, da lim kan fluorescere, hvilket komplicerer billeddannelsen.
- Vent, indtil limen størkner. Bekræft, at holderen er sikret mod dækslippen.
BEMÆRK: P35 celleplader med glasbundsdæksler blev brugt til de eksperimenter, der blev præsenteret i dette manuskript. Andre glasbundsrutsjebaner og/eller plader kan erstattes baseret på eksperimentets behov.
4. Sår af øjenkuglerne
- Fjern kuglerne fra farvningsopløsningen ved hjælp af sterile øjendråber, og pas på at forhindre vævsskade på interesseområdet. Vask kuglerne i 5 minutter ved stuetemperatur ved hjælp af sterilt fosfatbufferet saltvand for at fjerne overskydende plet, og placer kuglerne i mediet til transport til mikroskopet.
- Vikl kuglerne ved hjælp af en steril 25 G nål i interesseområdet.
- Brug en steril øjendråber til at samle og holde kloden op fra bagsiden af øjet. Dette vil holde kloden stabil, forhindre den i at rulle og tillade konsekvente sår. Ved hjælp af denne opsætning vil synsnerven være inde i øjendråberdysen, og hornhinden vender udad.
- For et ridsesår skal du forsigtigt flytte en steril 25 G nål hen over den udsatte hornhinde. For et punkteringssår skal du forsigtigt trykke nålen direkte ind i den centrale hornhinde. Sørg for, at såret ikke punkterer hornhinden.
BEMÆRK: Spring dette trin over, hvis der ikke kræves et sårrespons eller et såret miljø til eksperimentet. Tidligere undersøgelser har vist, at både ridsesår og punkteringssår på murinhornhinder fremstillet ved hjælp af denne metode er konsistente i både diameter og dybde10. Bekræftelse af sårdimensionerne mellem uafhængige kloder blev udført ved hjælp af en region af interesseanalyse.
5. Prøveplacering på indehaveren
- Placer hornhinden eller det limbale område på dækslippen i holderens indre område, og stabiliser ved hjælp af det 3D-printede omslag (figur 1C-H).
- Bekræft, at kloden er placeret korrekt, og at det interessante sted er i kontakt med glasdækslet. Når globussen er anbragt i holderen, skal du ikke forsøge at fjerne globussen, da dette kan forårsage vævsskade.
- Fastgør det 3D-printede dæksel til holderen ved hjælp af lim, hvilket sikrer stabilisering. Sørg for, at dækbjælken klæber til holderen og ikke kloden.
BEMÆRK: Det område, der skal afbildes, er placeret ned, fordi protokollen er skrevet til brug på et omvendt mikroskop. Protokollen kan tilpasses til opretstående mikroskoper ved hjælp af holdere med en mindre indre radius og fjernelse af dækstangen. Dette vil resultere i mindre stabilisering af kloden.
6. Prøvebilleddannelse
- Tænd mikroskopet og miljøkammeret, og kontroller, at kammeret er befugtet. Miljøkammeret indstilles til 35 °C og 5 % CO2 i forsøgets varighed.
BEMÆRK: Mikroskoper med miljøkamre foretrækkes til denne procedure for at forhindre dehydrering og for at holde kloden ved optimale temperaturer, men er ikke påkrævet. - Placer dækslip, holder og stabiliseret klode på mikroskopstadiet i miljøkammeret og billedet ved hjælp af levende cellebilleddannelsesteknikker9.
- Pipetter yderligere vækstmedier på dækslippet for at forhindre dehydrering og opretholde vævets levedygtighed. Sørg for, at der er nok medium i brønden til at dække kloden i holderen. Afhængigt af billeddannelsens varighed skal du tilføje nyt medium, når det er nødvendigt under hele eksperimentet.
- Begynd eksperimenter ved hjælp af levende cellebilleddannelsesteknikker og protokoller. Brug laserindstillinger med lav effekt til at bevare vævet og forhindre vævsskade i langvarige eksperimenter. Brug passende mål for lange arbejdsafstande. Eksperimenterne i dette manuskript blev udført ved hjælp af et 20x mål.
BEMÆRK: Laserkraft og forstærkning, eksperimentel varighed, placering og billeddannelsesplan er alle variabler afhængigt af de eksperimentelle parametre. Billeddannelseseksperimenter på intakte kloder af forskellig varighed fra 1 time til 4 timer er blevet udført med succes i tidligere publikationer10. - Optag og gem data i det foretrukne filformat. Den software, der bruges af mikroskopet, producerer .czi-filer til dataoptagelse.
- Bortskaf globerne i henhold til de almindelige institutionelle protokoller i slutningen af protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er blevet brugt til konsekvent at producere data og billeder i publikationskvalitet10. De opnåede billeder repræsenterer en betydelig forbedring sammenlignet med tidligere tilgange (figur 2). Ved hjælp af den 3D-printede holder kan billeder tages i hele lagene af hornhinden, og calciummobilisering i forskellige z-planer kan observeres (figur 3). Denne tilgang er blevet brugt til at sammenligne cellecellesignalering mellem apikale og basale cellelag ved et sår hos unge og gamle mus10.
Den forbedrede stabilitet har også gjort det muligt at afbilde glober i betydeligt længere tid end tidligere muligt. Dette har gjort det muligt at forlænge undersøgelser af cellulær migration i sårlejet med flere timer ud over tidligere muligheder. Med denne udvidede tidslinje kan der observeres betydelige forskelle i cellulær adfærd under sårhelingsresponsen mellem unge og gamle mus efter hornhindeskade10. Til denne protokol blev data indsamlet hvert 5. minut i 4 timer. Ved brug af holderen blev der ikke observeret nogen signifikant drift i x-, y- eller z-planete i løbet af eksperimentet (figur 4, video 1).
En fordel ved denne protokol er, at den gør det muligt at afbilde forskellige regioner i hornhinden baseret på placeringen af kloden i holderen. I en nylig publikation blev denne funktion udnyttet til at samle billeder både ved den centrale hornhinde og i hornhinde-limbalområdet (figur 5)10. En skade på den centrale hornhinde viste sig at producere calciumsignaleringshændelser i celler ved siden af nerverne i limbalområdet10. Holderens alsidighed går ud over at stabilisere kloden til billeddannelseseksperimenter og er blevet brugt til flere forskellige applikationer. Ved at placere hornhinden med forsiden opad i holderen blev der udført nanoindentationsforsøg for at måle stivheden af hornhindeepitelet, kældermembranen og stroma hos unge og gamle mus10,11.
Figur 1: Skemaer og opsætning af den 3D-printede holder. (A) Design af den 3D-printede holder med kommenterede højde- og breddedimensioner. (B) Repræsentativt CAD-filbillede fra 3D-printersoftwaren. (C) Repræsentativt billede af holderen med det vedhæftede dæksel, der indeholder en murine globus. (D) Steril engangslim påføres bunden af den 3D-printede holder. (E) Den 3D-printede holder klæbes til en p35-cellekulturskål med glasbund. (F) En enukleeret globus anbringes hornhinde-ned i holderen ved hjælp af en steril øjendråber. (G) Dækstangen klæbes til toppen af den 3D-printede holder for at sikre immobilisering af kloden. (H) Glasbundpladen med en klæbet holder og globus placeres på mikroskoptrinnet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Brug af specialiserede 3D-printede holdere til at stabilisere kloden og give billeddata af højere kvalitet af flerlagsstrukturer. (A) og (B) repræsenterer typiske levende billeddata for en såret ex vivo hornhinde stabiliseret uden henholdsvis og med en 3D-trykt holder. Calciumsignaleringshændelser (grøn) og cellemodfarve (dyb rød plasmamembranplet) kan tydeligt identificeres i de apikale, basale og stromale lag af hornhinden i (B), men ikke i (A). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Z-stak af en hornhinde immobiliseret i den 3D-printede holder. Repræsentative billeder af en z-stak taget gennem lagene af hornhinden ved et ridsesår (betegnet med en hvid stjerne). Prøven er farvet med dyb rød plasmamembranplet for at visualisere cellemembranerne og Fluo4-AM (grøn) for at visualisere calciumsignalering. (A) Det apikale cellelag, (B) apikale og basale celler, (C) basalcellelag og (D) stroma kan ses i sårlejet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativt 4 timers tidsserieeksperiment af en hornhinde, der afslører lille bevægelse af kloden i x-, y- eller z-retningerne. Billedet er af en ridsesårskade (betegnet med en hvid stjerne) ved den centrale hornhinde i en ex vivo murine globus. Kloden er farvet med dyb rød plasmamembranplet for at visualisere cellemembranerne og Fluo4-AM (grøn) for at visualisere calciumsignaleringshændelser. Kloden immobiliseres ved hjælp af en 3D-printet holder. Billederne blev taget 1 time fra hinanden, begyndende 5 min efter skade. Lidt drift i x-, y- eller z-retningerne blev observeret ved hjælp af denne billeddannelsesopsætning i løbet af eksperimentet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Diagram over billedplaceringer på en intakt globus. Den 3D-printede holder tillader billeddannelse af en intakt ex vivo-globus forskellige steder. Indehaveren blev brugt til at indsamle billeder fra både de centrale og limbale regioner i hornhinden. Glober er farvet med dyb rød plasmamembranplet for at detektere cellemembranerne og Fluo4-AM (grøn) for at detektere calciumsignalering. (A) Repræsentativt billede af den centrale hornhinde ved et ridsesår. (B) Repræsentativt billede af hornhindens limbale område efter en skade på den centrale hornhinde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Film af en globus immobiliseret i en 3D-printet holder i 4 timer. En globus blev immobiliseret med den 3D-printede holder og farvet med dyb rød plasmamembranplet (rød) for at visualisere cellemembranerne og Fluo4-AM (grøn) for at visualisere calciumsignaleringshændelser. Der blev taget et billede hvert 5. minut i 4 timer, begyndende 5 minutter efter skade. Lidt drift i x-, y- eller z-retningerne blev observeret ved hjælp af denne billeddannelsesopsætning i løbet af eksperimentet. Afspilningshastigheden er 30 billeder i sekundet. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en levende cellebilleddannelsesteknik, der bruger en 3D-trykt holder til at stabilisere og immobilisere intakte dyreøjne. Det er designet til at omgå flere væsentlige ulemper, der er anerkendt med tidligere levende cellebilleddannelsesprotokoller af ex vivo hornhindevæv. Denne protokol giver mange fordele for levende cellebilleddannelse af intakte kloder. Det reducerer unødvendig vævsskade betydeligt, der kan forstyrre sårhelingsresponset på eksperimentelt inducerede ridsesår. Dette omfatter skader på nerver og epitel fra dissektion og udsættelse for UV-lys. Desuden letter denne protokol vævshydrering og levedygtighed ved at immobilisere vævet på en måde, der gør det muligt at anvende vækstmedium med jævne mellemrum uden afbrydelse af eksperimenterne. Ved at ændre øjets orientering i holderen giver protokollen mulighed for billeddannelse af forskellige regioner på kloden. Brugen af konfokal mikroskopi sammen med denne protokol tillader billeddannelse af forskellige planer af kloden, hvilket muliggør observation af interaktioner mellem vævsstrukturer. Protokollen er meget alsidig og kan tilpasses glober i forskellige størrelser fra mus og andre arter. Holderne og dækslerne kan let fjernes fra billeddannelsesbrøndene, steriliseres og genbruges. 3D-udskrivningsprotokollen er effektiv og tidseffektiv, hvilket giver mulighed for praktisk oprettelse af mange indehavere ad gangen. Kuglerne kan fastgøres i holderne, hvis prøverne skal opbevares og afbildes igen på et senere tidspunkt. Fast væv bevarer dyb rød plasmamembranplet og Fluo4-AM-pletter i flere uger efter fiksering, som kan bruges som markører ved farvning af et eller flere specifikke proteiner.
Tidligere protokoller krævede dissektion af øjet og efterfølgende brug af en UV-aktiveret PEG-gel til at immobilisere hornhinden til billeddannelse 7,8,9. Skader på vævet ved hjælp af disse teknikker kan forvirre eksperimentelle resultater. Dette er især vigtigt at overveje, når man studerer de cellulære og vævsprocesser, der er involveret i sårheling, da denne yderligere skade ud over de eksperimentelt påførte sår kan ændre sårhelingsresponset 4,12. Indgangen af sensoriske hornhindenerver vil blive påvirket af den tidligere protokol, da dissektionsprocessen skærer nerverne fra deres cellelegemer i trigeminal ganglion13. Desuden ville dissektionen af hornhinden i sig selv forårsage et skadesrespons, da opløselige faktorer frigivet fra en skade er ansvarlige for sårhelingsresponsen4. Denne nye procedure løser disse svagheder ved at billeddanne kloderne intakte. Ved hjælp af denne metode er skader på øjet begrænset til skæring af synsnerven ved enukleation og opretholder cellelevedygtighed i hornhinden i længere tid. Tilsammen skaber disse forbedringer en bedre simulering af sårresponsen.
Immobilisering er et vigtigt, men udfordrende trin, når man arbejder med levende væv, da det skal forblive levedygtigt og hydreret i løbet af eksperimentet. Mens hornhinderne og kuglerne kunne sikres med UV-induceret PEG-gel, kræver proceduren UV-bestråling efter anbringelse af vævet i holderen8. Det blev observeret, at den bestråling, der kræves for at polymerisere PEG, nedsatte cellulær lydhørhed. Desuden reducerede PEG opløsningen af billederne, og AiryScan-funktionen var påkrævet for at observere cellesignalering. I denne nye protokol er holderens dimensioner optimeret til nøjagtigt at passe til globerne, og dækstangen giver et ekstra lag af immobilisering. Holderen og dækbjælken eliminerer behovet for at bruge PEG, som producerer billeder i højere kvalitet og højere opløsning med realtidsoptagelser af sårhelingsprocessen. En løsning på de ovennævnte problemer ville være at give helt afkald på levende cellebilleddannelse og fiksere globerne i paraformaldehyd (4%) på forudbestemte tidspunkter efter skade. Men med fast væv kan igangværende cellulære processer såsom calciumsignalering og virkningerne af disse processer på fysiske ændringer i vævet ikke observeres. For grupper, der er interesseret i at registrere og kvantificere kommunikationshændelser mellem celler i hornhindeepitelet, gør de grænser, der pålægges ved vævsfiksering, denne teknik upraktisk til sådanne formål.
Denne nye protokol har to vigtige trin: (1) eutanasi og øjeblikkelig globus-enukleation og (2) positionering og orientering af kloden inden for indehaveren. Skæringen af synsnerven og enukleationen af kloden skal udføres omhyggeligt ved at støtte øjet uden at placere en bøjle for at bevare de indre og ydre strukturer. Positionering og orientering er nødvendig for billeddannelse af de interessante steder og sikring af, at det størst mulige synsfelt er i fokus med tilstrækkelige detaljer. Korrekt placering af globussen er nødvendig, før dækstangen påføres holderen.
Flere variabler i protokollen kan justeres afhængigt af kravene i de eksperimentelle parametre. Holderne kan udskrives i forskellige størrelser for at rumme glober i forskellige volumener. Parametrene vedrørende holderdiameter og højde i forhold til klodens størrelse forbliver de samme på tværs af størrelsesintervaller. Hvis brugeren oplever drift i z-planet, kan den potentielle årsag være, at vævet ikke er immobiliseret, og holderen skal genfremstilles. Farvningen af de intakte kloder kan justeres afhængigt af de eksperimentelle parametre, de anvendte pletter og det optimale miljø og koncentrationer for vævet af interesse. Den eksperimentelle varighed kan justeres, så længe vævets levedygtighed opretholdes. Kortvarige eksperimenter, der involverer 1 times konstant billeddannelse af vævet og langsigtede eksperimenter, der involverer billeddannelse af vævet med jævne mellemrum i løbet af 4 timer, er begge blevet udført med succes. Disse eksperimenter blev udført på et omvendt mikroskop, og denne protokol blev designet til optimal brug med en lignende billeddannelsesopsætning. Når kloden er stabiliseret og placeret i holderen, kan fjernelse af kloden resultere i vævsskade; Således er optimal positionering og orientering af kloden, før dækstangen fastgøres, afgørende. Globerne kan fastgøres i 4% paraformaldehyd, mens de stadig er inden for indehaverne til yderligere analyse af proteinlokalisering. Foreløbige data har vist, at dybrød plasmamembranplet og Fluo4-AM-farvning begge bevares gennem fikseringsprocessen.
Selvom denne protokol har mange fordele i forhold til tidligere protokoller, er der et par begrænsninger for denne eksperimentelle tilgang. En ulempe er, at det er svært at fjerne kloden fra holderen uden at beskadige hornhindeepitelet. Således skal kloden fastgøres i holderen til genbilleddannelse ved hjælp af protein- eller RNA-lokaliseringsmetoder på et senere tidspunkt. Dette kan begrænse opfølgende undersøgelser. En anden ulempe ved denne protokol under langvarige billeddannelsesprotokoller er, at hydrering skal opretholdes. Behovet for manuelt at genanvende mediet med jævne mellemrum kræver, at nogen aktivt overvåger billeddannelsesprocessen for eksperimentets omfang. Dette kan vise sig logistisk udfordrende for udvidede billedbehandlingsprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende NIH for følgende tilskudsstøtte: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) og 5T32GM008541-24 (KS). Vi vil også gerne anerkende Massachusetts Lions Eye Research Fund og New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
