体内 通过乳腺导管内注射将基因传递到小鼠乳腺上皮细胞
Summary
本协议描述了通过 在 导管内注射病毒载体以将感兴趣的基因递送到乳腺上皮细胞中。
Abstract
小鼠乳腺由导管树组成，导管树由上皮细胞衬里，每个的尖端都有一个开口。上皮细胞在乳腺功能中起主要作用，是大多数乳腺肿瘤的起源。将感兴趣的基因引入小鼠乳腺上皮细胞是评估上皮细胞基因功能和生成小鼠乳腺肿瘤模型的关键步骤。该目标可以通过在导管内注射携带目标基因的病毒载体到小鼠乳腺导管树中来实现。注射的病毒随后感染乳腺上皮细胞，带来感兴趣的基因。病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺病毒相关病毒 （AAV）。这项研究证明了目的基因如何通过小鼠乳腺导管内注射病毒载体递送到乳腺上皮细胞中。携带 GFP 的慢病毒用于显示递送基因的稳定表达，携带 Erbb2 （HER2 / Neu）的逆转录病毒用于显示癌基因诱导的非典型增生病变和乳腺肿瘤。
Introduction
乳腺的上皮细胞在这些腺体的功能中起着重要作用，是乳腺癌的主要起源细胞。乳腺生物学和肿瘤发生的研究经常需要将感兴趣的基因递送到这些细胞中。每个小鼠乳腺包括一棵由上皮细胞衬里的导管树，顶端有一个开口。这种结构使乳腺上皮细胞易于被病毒载体接近，病毒载体可以通过导管内注射传递到导管树的腔内1。
乳腺导管内注射技术最初用于更大的动物，如山羊、兔子和大鼠1。对于像小鼠这样小得多的动物，导管内注射需要许多精密的工具和操作人员的更多实践。小鼠导管内注射有两种方法。一种是注射1。另一种是在手术暴露后直接注射#3或#4乳腺的初级导管1。由于第一种是非侵入性的，一旦操作员经过良好的培训，就会更快，因此这种技术更常用，本文将详细描述。
与广泛使用的传统转基因小鼠模型相比，在受精卵阶段通过显微注射2，3，4引入目的基因，通过导管内病毒注射方法传递基因具有许多优点，包括：（1）避免了为每个目的基因制作转基因小鼠系的耗时过程;（2）避免目的基因对乳腺正常发育的潜在损害;（3）它在出生后的任何期望时间引入目的基因;（4）它可以很容易地共同引入一个以上的目的基因;（5）它更好地模仿了自然致瘤过程，因为感染的细胞和携带癌基因的细胞被正常细胞包围;（6）结合TVA（肿瘤病毒A，一种禽细胞表面蛋白和逆转录病毒RCAS载体的受体）技术5，可以将目的基因引入特定的细胞群中，以研究肿瘤发生的细胞起源并在乳腺6，7，8中进行细胞谱系追踪测定，9.
任何来源于逆转录病毒 10、慢病毒 11、12、腺病毒 13 和腺病毒相关病毒 （AAV）14 的载体都可用于导管内递送遗传物质。逆转录病毒和慢病毒载体永久整合到宿主基因组中;因此，它们将感兴趣的基因稳定地引入乳腺上皮细胞。虽然慢病毒可以整合到它遇到的任何细胞的基因组中15，但逆转录病毒的有效基因组整合需要靶细胞的增殖16。腺病毒和AAV载体不整合到感染细胞的基因组中，因此仅瞬时表达目的基因17，18。当目的基因只需要表达很短的时间（例如Cre）以删除絮状肿瘤抑制基因时，此功能可能是一个优势。
慢病毒、腺病毒和AAV感染它们遇到的任何小鼠细胞。但是，由于管腔上皮在很大程度上与下面的基底层绝缘，基底层通过基底膜与基质进一步分离，因此导管内注射将感染主要限制在管腔上皮细胞，这是乳腺癌起源的主要细胞。在这个管腔上皮层内，也有不同的细胞亚型，包括干细胞、祖细胞和几组分化细胞。为了感染管腔细胞群中的特定细胞亚群，可以使用TVA技术，其中禽白血病病毒衍生的RCAS载体5，10或假型慢病毒载体11选择性地感染在细胞类型特异性启动子控制下携带TVA转基因的小鼠中表达TVA的细胞，例如仅在干细胞6或某些祖细胞6中活跃的启动子6，肺泡细胞7或Wnt通路活性细胞8或Wnt通路活性细胞9。
该协议介绍了通过导管内注射病毒载体将感兴趣的基因引入乳腺上皮细胞的技术。然后证明引入基因的表达以及由此产生的增生病变和肿瘤的检测。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文展示了将基因引入小鼠乳腺上皮细胞以模拟散发性乳腺癌的病毒导管内注射技术。通常，注射至少5周或更大的小鼠，以便在乳腺发育后开始致癌过程。此外，5周龄以下小鼠的开口通常太小而无法注射。另一方面，非常老的小鼠的有时会退化，横断可能无法揭示导管开口。同样重要的是要注意，由于种系基因突变引起的异常乳腺发育，一些转基因或敲除肿瘤模型的也可能难以注射。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Gary Chamness博士对这份手稿的有益评论。这项工作得到了国防部（DOD）CDMRP BC191649（YL）和BC191646（YL）以及美国国立卫生研究院（NIH）CA271498（YL）的支持。作者要感谢由SPORE P50CA186784支持的乳腺中心病理学核心设施，以及由CPRIT-RP180672，NIH CA125123和RR024574支持的细胞术和细胞分选核心在Joel M. Sederstrom的协助下。
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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