ב Vivo העברת גנים לתאי אפיתל חלב עכבר באמצעות הזרקה intraductal חלב
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה אינטרדוקטלית של וקטורים נגיפיים דרך הטיט כדי להעביר גנים מעניינים לתאי אפיתל החלב.
Abstract
בלוטות החלב של העכבר מורכבות מעצים צינוריים, המרופדים בתאי אפיתל ויש להם פתח אחד בקצה כל פטמה. תאי האפיתל ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטת החלב והם המקור לרוב גידולי החלב. החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל של חלב עכברים היא צעד קריטי בהערכת תפקוד גנים בתאי אפיתל ויצירת מודלים של גידולי חלב עכבריים. מטרה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי הנושא את הגנים של עניין לתוך עץ החלב עכבר. הנגיף המוזרק מדביק לאחר מכן תאי אפיתל חלב, ומביא את הגנים המעניינים. הווקטור הנגיפי יכול להיות לנטיויראלי, רטרו-ויראלי, אדנוביראלי או אדנו-וירוס הקשור לנגיפים (AAV). מחקר זה מדגים כיצד גן מעניין מועבר לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה אינטרדוקטלית של וקטור נגיפי של עכבר. לנטיוירוס הנושא GFP משמש להצגת ביטוי יציב של גן מועבר, ורטרו-וירוס הנושא Erbb2 (HER2/Neu) משמש להדגמת נגעים היפרפלסטיים לא טיפוסיים הנגרמים על ידי אונקוגנים וגידולי חלב.
Introduction
תאי אפיתל של בלוטות החלב ממלאים תפקיד מרכזי בתפקוד בלוטות אלה והם תא המקור העיקרי של סרטן השד. מחקרים על ביולוגיה של בלוטת החלב וגידולים לעתים קרובות זקוקים להעברת גנים בעלי עניין לתאים אלה. כל בלוטת חלב של עכבר מורכבת מעץ צינורי מרופד בתאי אפיתל עם פתח יחיד בקצה הפטמה. מבנה זה הופך את תאי אפיתל החלב לנגישים בקלות לווקטורים נגיפיים, אשר יכולים להיות מועברים לתוך לומן של עץ דוקטלי באמצעות הזרקה intraductal1.
הטכניקה של הזרקה intraductal חלב שימש במקור עבור בעלי חיים גדולים בהרבה כגון עזים, ארנבות, חולדות1. עבור חיה קטנה בהרבה כמו עכברים, הזרקה אינטרדוקטלית דורשת כלים עדינים רבים ושיטות עבודה רבות יותר של המפעילים. ישנן שתי גישות להזרקת עכבר intraductal. האחת היא זריקה1. עוד אחד הוא הזרקה ישירה של הצינור הראשוני של #3 או #4 בלוטת החלב לאחר חשיפה כירורגית1. מכיוון שהראשון אינו פולשני ומהיר יותר ברגע שהמפעיל הוכשר היטב, טכניקה זו נפוצה יותר ותתואר בפירוט במאמר זה.
בהשוואה למודלים הנפוצים של עכברים טרנסגניים מסורתיים, שבהם הגן המעניין מוצג בשלב של ביציות מופרות באמצעות מיקרו-הזרקה 2,3,4, להעברת גנים בשיטת הזרקת הנגיף התוך צינורי יש יתרונות רבים, כולל: (1) הוא מונע את התהליך הגוזל זמן של יצירת קו עכבר מהונדס עבור כל גן מעניין; (2) הוא מונע פגיעה פוטנציאלית בהתפתחות תקינה של בלוטות החלב המוטלת על ידי הגן המעניין; (3) הוא מציג את הגן המעניין בכל עת רצויה לאחר הלידה; (4) הוא יכול בקלות להכניס במשותף יותר מגן אחד של עניין; (5) הוא מחקה טוב יותר את התהליך הגידולי הטבעי משום שהתאים הנגועים ולכן נושאי האונקוגן מוקפים בתאים נורמליים; ו-(6) בשילוב עם טכנולוגיית TVA (וירוס הגידול A, חלבון פני השטח של תאי העופות והקולטן לווקטור RCAS רטרו-וירוס)5, ניתן להחדיר את הגן המעניין לאוכלוסיית תאים ספציפית כדי לחקור את מקור התא של גידולים ולבצע בדיקות מעקב אחר שושלת תאים בבלוטות החלב 6,7,8, 9.
כל וקטור הנגזר רטרווירוס10, lentivirus 11,12, adenovirus13, ווירוס הקשור אדנווירוס (AAV)14 עשוי לשמש להעברה intraductal של חומרים גנטיים. רטרו-וירוס ווקטורים של לנטי-וירוס משתלבים בגנום המארח לצמיתות; לכן, הם מציגים גנים של עניין יציב לתוך תאי אפיתל החלב. בעוד שלנטיוירוס יכול להשתלב בגנום של כל תא שהוא פוגש15, האינטגרציה הגנומית היעילה של רטרו-וירוס זקוקה להתרבות תאי המטרה16. וקטורי אדנו-ויראלי ו-AAV אינם משתלבים בגנום של תאים נגועים, ולכן מבטאים רק באופן ארעי את הגן המעניין17,18. תכונה זו יכולה להוות יתרון כאשר הגן המעניין צריך לבוא לידי ביטוי לפרק זמן קצר בלבד, כגון Cre, למחיקת גן מדכא גידול פלוקס.
Lentivirus, adenovirus, ו- AAV מדביקים כל תאי עכבר שהם נתקלים בהם. אך מכיוון שהאפיתל הלומינלי מבודד במידה רבה מהשכבה הבסיסית הבסיסית, המופרדת עוד יותר מהסטרומה על ידי קרום המרתף, הזרקה אינטרדוקטלית מגבילה את הזיהום בעיקר לתאי אפיתל לומינליים, התא העיקרי של מוצא סרטן השד. בתוך שכבת אפיתל לומינלית זו, ישנם גם תת-סוגים שונים של תאים, כולל תאי גזע, תאי אב וכמה קבוצות של תאים ממוינים. כדי להדביק תת-קבוצות תאים ספציפיות באוכלוסיית התאים הלומינליים, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TVA, שבה וקטורים RCAS5,10 שמקורם בנגיף לויקוזיס העופות או וקטורים לנטי-ויראליים פסאודו-טיפיים11 מדביקים באופן סלקטיבי את התאים המבטאים TVA בעכברים הנושאים טרנסגן TVA תחת שליטתו של מקדם ספציפי לסוג התא, כגון מקדם הפעיל רק בתאי גזע 6 או אבות מסוימים 6, 7 או תאים מכתשית8 או תאים פעילים במסלול Wnt9.
פרוטוקול זה מציג את הטכניקה של החדרת גנים מעניינים לתאי אפיתל חלב באמצעות הזרקה intraductal של וקטור נגיפי. לאחר מכן מודגם זיהוי הביטוי של הגנים שהוכנסו והנגעים ההיפרפלסטיים והגידולים המתקבלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מדגים את טכניקת ההזרקה התוך-צינורית הנגיפית להחדרת גנים לתאי אפיתל חלב של עכברים לצורך מידול סרטן שד ספורדי. בדרך כלל, עכברים של לפחות 5 שבועות ומעלה מוזרקים כך התהליך האונקוגני מתחיל לאחר התפתחות בלוטת החלב. חוץ מזה, פתח הפטמה של עכברים מתחת לגיל 5 שבועות הוא לעתים קרובות קטן מדי לה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר גארי צ’מנס על הערותיו המועילות על כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה (DOD) CDMRP BC191649 (YL) ו- BC191646 (YL) כמו גם המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) CA271498 (YL). המחברים רוצים להודות למתקן הליבה הפתולוגית של מרכז השד הנתמך על ידי SPORE P50CA186784, ולליבת הציטומטריה ומיון התאים הנתמכת על ידי CPRIT-RP180672, NIH CA125123 ו- RR024574 בסיועו של ג’ואל מ. סדרסטרום.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
References
- Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. , 259-270 (2000).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
- Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
- Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
- Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Recherche en cancérologie. 79 (1), 61-71 (2019).
- Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
- Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
- Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
- Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
- Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
- Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
- Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
- Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Biologie du développement. 346 (2), 196-203 (2010).
- Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
- Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
- Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
- Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
- Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
- Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
- Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
- Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
- Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).
