İn Vivo Meme İntraduktal Enjeksiyon Yoluyla Fare Meme Epitel Hücrelerine Gen İletimi
Summary
Bu protokol, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine iletmek için meme ucu yoluyla viral vektörlerin intraduktal enjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
Fare meme bezleri, epitel hücreleri tarafından kaplanmış ve her meme ucunun ucunda bir açıklığa sahip olan duktal ağaçlardan oluşur. Epitel hücreleri meme bezi fonksiyonunda önemli bir rol oynar ve çoğu meme tümörünün kökenidir. İlgilenilen genlerin fare meme epitel hücrelerine tanıtılması, epitel hücrelerinde gen fonksiyonunun değerlendirilmesinde ve fare meme tümörü modellerinin oluşturulmasında kritik bir adımdır. Bu hedef, ilgilenilen genleri fare meme duktal ağacına taşıyan viral bir vektörün intraduktal enjeksiyonu ile gerçekleştirilebilir. Enjekte edilen virüs daha sonra meme epitel hücrelerini enfekte eder ve ilgilenilen genleri getirir. Viral vektör lentiviral, retroviral, adenoviral veya adenovirüs ilişkili viral (AAV) olabilir. Bu çalışma, ilgilenilen bir genin, viral bir vektörün fare meme intraduktal enjeksiyonu yoluyla meme epitel hücrelerine nasıl verildiğini göstermektedir. GFP taşıyan bir lentivirüs, verilen bir genin stabil ekspresyonunu göstermek için kullanılır ve onkogen kaynaklı atipik hiperplastik lezyonları ve meme tümörlerini göstermek için Erbb2 (HER2 / Neu) taşıyan bir retrovirüs kullanılır.
Introduction
Meme bezlerinin epitel hücreleri, bu bezlerin işlevinde önemli bir rol oynar ve meme kanserinin ana menşe hücresidir. Meme bezi biyolojisi ve tümörigenez çalışmaları sıklıkla bu hücrelere ilgi çekici genlerin verilmesini gerektirir. Her fare meme bezi, meme ucunun ucunda tek bir açıklığa sahip epitel hücreleri tarafından kaplanmış bir duktal ağaçtan oluşur. Bu yapı, meme epitel hücrelerini, intraduktal enjeksiyon1 yoluyla bir duktal ağacın lümenine verilebilen viral vektörlere kolayca erişilebilir hale getirir.
Meme intraduktal enjeksiyon tekniği başlangıçta keçi, tavşan ve sıçan gibi çok daha büyük hayvanlar için kullanılmıştır1. Fareler gibi çok daha küçük bir hayvan için, intraduktal enjeksiyon birçok hassas alete ve operatörlerin daha fazla uygulamasına ihtiyaç duyar. Fare intraduktal enjeksiyonu için iki yaklaşım vardır. Biri meme ucu enjeksiyonu1’dir. Bir diğeri, cerrahi maruziyetten sonra # 3 veya # 4 meme bezinin birincil kanalının doğrudan enjeksiyonudur1. Birincisi, operatör iyi eğitildikten sonra non-invaziv ve daha hızlı olduğundan, bu teknik daha yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu makalede ayrıntılı olarak açıklanacaktır.
İlgilenilen genin mikroenjeksiyon yoluyla döllenmiş yumurtalar aşamasında tanıtıldığı yaygın olarak kullanılan geleneksel transgenik fare modelleriyle karşılaştırıldığında 2,3,4, intraduktal virüs enjeksiyon yöntemiyle gen dağıtımının aşağıdakiler de dahil olmak üzere birçok avantajı vardır: (1) ilgilenilen her gen için transgenik bir fare çizgisi yapmanın zaman alıcı sürecinden kaçınır; (2) ilgili gen tarafından dayatılan meme bezlerinin normal gelişimi üzerindeki potansiyel bozulmayı önler; (3) İlgilenilen geni doğumdan sonra istenen herhangi bir zamanda tanıtır; (4) birden fazla ilgili geni kolayca birlikte tanıtabilir; (5) doğal tümörojenik süreci daha iyi taklit eder, çünkü enfekte olmuş ve dolayısıyla onkogen taşıyan hücreler normal hücrelerle çevrilidir; ve (6) TVA (tümör virüsü A, bir kuş hücre yüzey proteini ve retrovirüs RCAS vektörü için reseptör) teknolojisi5 ile kombinasyon halinde, ilgili gen, tümörigenezin hücre kökenini incelemek ve meme bezlerinde hücre soy izleme testleri yapmak için belirli bir hücre popülasyonuna sokulabilir 6,7,8, 9.
Retrovirüs 10, lentivirüs11,12, adenovirüs 13 ve adenovirüs ilişkili virüs (AAV) 14’ten türetilen herhangi bir vektör, genetik materyallerin intraduktal dağıtımı için kullanılabilir. Retrovirüs ve lentivirüs vektörleri konakçı genomuna kalıcı olarak entegre olur; Böylece, ilgilenilen genleri meme epitel hücrelerine istikrarlı bir şekilde sokarlar. Lentivirüs, karşılaştığı herhangi bir hücrenin genomuna entegre olabilirken,15, retrovirüsün etkili genomik entegrasyonu, hedef hücrelerin çoğalmasına ihtiyaç duyar16. Adenoviral ve AAV vektörleri, enfekte olmuş hücrelerin genomuna entegre olmaz ve bu nedenle, sadece geçici olarak ilgilenilen geni eksprese eder17,18. Bu özellik, ilgili genin, flokslu bir tümör baskılayıcı genin silinmesi için Cre gibi kısa bir süre için ifade edilmesi gerektiğinde bir avantaj olabilir.
Lentivirüs, adenovirüs ve AAV, karşılaştıkları fare hücrelerini enfekte eder. Ancak luminal epitel, bazal membran tarafından stromadan daha da ayrılan altta yatan bazal tabakadan büyük ölçüde izole edildiğinden, intraduktal enjeksiyon, enfeksiyonu büyük ölçüde meme kanserinin birincil hücresi olan luminal epitel hücrelerine sınırlar. Bu luminal epitel tabakası içinde, kök hücreler, progenitör hücreler ve birkaç farklılaşmış hücre grubu dahil olmak üzere farklı hücre alt tipleri de vardır. Luminal hücre popülasyonu içindeki spesifik hücre alt kümelerini enfekte etmek için, kuş lökoz virüsü türevi RCAS vektörleri 5,10 veya psödotiplenmiş lentiviral vektörler11’in, sadece kök hücrelerde aktif olan bir promotör 6 veya belirli progenitörlerdeaktif olan bir promotör gibi hücre tipine özgü bir promotörün kontrolü altında bir tva transgeni taşıyan farelerde TVA’yı eksprese eden hücreleri seçici olarak enfekte ettiği TVA teknolojisi kullanılabilir. 7 veya alveolar hücreler8 veya Wnt yolu aktif hücreler9.
Bu protokol, bir viral vektörün intraduktal enjeksiyonu yoluyla meme epitel hücrelerine ilgili genlerin sokulması tekniğini sunar. Tanıtılan genlerin ekspresyonunun ve bunun sonucunda ortaya çıkan hiperplastik lezyonların ve tümörlerin tespiti daha sonra gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, sporadik meme kanserini modellemek için fare meme epitel hücrelerine genleri sokmak için viral intraduktal enjeksiyon tekniği gösterilmektedir. Genellikle, en az 5 hafta veya daha büyük farelere enjekte edilir, böylece onkojenik süreç meme bezi geliştikten sonra başlar. Ayrıca, 5 haftalıktan küçük farelerin meme ucu açıklığı genellikle enjeksiyon için çok küçüktür. Öte yandan, çok yaşlı farelerin meme uçları bazen dejenere olur ve transeksiyon duktal bir açıklığı ortaya…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu makale hakkındaki yararlı yorumları için Dr. Gary Chamness’e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Savunma Bakanlığı (DOD) CDMRP BC191649 (YL) ve BC191646 (YL) ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) CA271498 (YL) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Joel M. Sederstrom’un yardımıyla SPORE P50CA186784 tarafından desteklenen Meme Merkezi Patoloji Çekirdek Tesisine ve CPRIT-RP180672, NIH CA125123 ve RR024574 tarafından desteklenen Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeğine teşekkür eder.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
References
- Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. , 259-270 (2000).
- Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
- Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
- Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
- Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
- Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Recherche en cancérologie. 79 (1), 61-71 (2019).
- Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
- Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
- Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
- Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
- Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
- Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
- Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
- McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
- Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Biologie du développement. 346 (2), 196-203 (2010).
- Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
- Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
- Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
- Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
- Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
- Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
- Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
- Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
- Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).
