In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria
Summary
El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.
Abstract
Las glándulas mamarias del ratón comprenden árboles ductales, que están revestidos por células epiteliales y tienen una abertura en la punta de cada pezón. Las células epiteliales juegan un papel importante en la función de la glándula mamaria y son el origen de la mayoría de los tumores mamarios. La introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias de ratón es un paso crítico en la evaluación de la función génica en las células epiteliales y la generación de modelos de tumores mamarios de ratón. Este objetivo se puede lograr a través de la inyección intraductal de un vector viral que lleva los genes de interés en el árbol ductal mamario del ratón. El virus inyectado posteriormente infecta las células epiteliales mamarias, trayendo los genes de interés. El vector viral puede ser lentiviral, retroviral, adenoviral o viral asociado a adenovirus (AAV). Este estudio demuestra cómo un gen de interés se administra en las células epiteliales mamarias a través de la inyección intraductal mamaria de ratón de un vector viral. Un lentivirus portador de GFP se utiliza para mostrar la expresión estable de un gen entregado, y un retrovirus portador de Erbb2 (HER2/Neu) se utiliza para demostrar lesiones hiperplásicas atípicas inducidas por oncogén y tumores mamarios.
Introduction
Las células epiteliales de las glándulas mamarias juegan un papel importante en la función de estas glándulas y son la principal célula de origen del cáncer de mama. Los estudios de la biología de las glándulas mamarias y la tumorigénesis con frecuencia necesitan la entrega de genes de interés en estas células. Cada glándula mamaria de ratón comprende un árbol ductal revestido por células epiteliales con una sola abertura en la punta del pezón. Esta estructura hace que las células epiteliales mamarias sean fácilmente accesibles para los vectores virales, que pueden ser entregados en la luz de un árbol ductal a través de la inyección intraductal1.
La técnica de inyección intraductal mamaria se utilizó originalmente para animales mucho más grandes como cabras, conejos y ratas1. Para un animal mucho más pequeño como los ratones, la inyección intraductal necesita muchas herramientas delicadas y más prácticas de los operadores. Existen dos enfoques para la inyección intraductal en ratones. Una es la inyección hasta la tetina1. Otra es la inyección directa del conducto primario de la glándula mamaria #3 o #4 después de la exposición quirúrgica1. Dado que la primera es no invasiva y más rápida una vez que el operador ha sido bien entrenado, esta técnica se usa más comúnmente y se describirá en detalle en este artículo.
En comparación con los modelos tradicionales de ratón transgénico ampliamente utilizados, en los que el gen de interés se introduce en la etapa de óvulos fertilizados a través de microinyección 2,3,4, la administración de genes a través del método de inyección intraductal de virus tiene muchas ventajas, que incluyen: (1) evita el proceso lento de hacer una línea de ratón transgénico para cada gen de interés; (2) evita el deterioro potencial en el desarrollo normal de las glándulas mamarias impuesto por el gen de interés; (3) introduce el gen de interés en cualquier momento deseado después del nacimiento; (4) puede cointroducir fácilmente más de un gen de interés; (5) imita mejor el proceso tumorigénico natural porque las células infectadas y, por lo tanto, portadoras de oncogenes están rodeadas por células normales; y (6) en combinación con la tecnología TVA (virus tumoral A, una proteína de la superficie celular aviar y el receptor para el vector RCAS del retrovirus)5, el gen de interés puede introducirse en una población celular específica para estudiar el origen celular de la tumorigénesis y realizar ensayos de rastreo del linaje celular en las glándulas mamarias 6,7,8, 9.
Cualquier vector derivado del retrovirus 10, lentivirus 11,12, adenovirus 13 y virus asociado a adenovirus (AAV)14 puede utilizarse para la administración intraductal de materiales genéticos. Los vectores de retrovirus y lentivirus se integran en el genoma del huésped de forma permanente; Por lo tanto, introducen genes de interés de manera estable en las células epiteliales mamarias. Mientras que el lentivirus puede integrarse en el genoma de cualquier célula que encuentre15, la integración genómica eficiente del retrovirus necesita la proliferación de las células diana16. Los vectores adenovirales y AAV no se integran en el genoma de las células infectadas y, por lo tanto, sólo expresan transitoriamente el gen de interés17,18. Esta característica puede ser una ventaja cuando el gen de interés necesita expresarse solo por un corto período de tiempo, como Cre, para eliminar un gen supresor de tumores floxed.
Lentivirus, adenovirus y AAV infectan cualquier célula de ratón que encuentren. Pero dado que el epitelio luminal está aislado en gran medida de la capa basal subyacente, que está más separada del estroma por la membrana basal, la inyección intraductal limita la infección en gran medida a las células epiteliales luminales, la célula primaria de origen del cáncer de mama. Dentro de esta capa epitelial luminal, también hay distintos subtipos de células, incluidas las células madre, las células progenitoras y varios grupos de células diferenciadas. Para infectar subconjuntos celulares específicos dentro de la población de células luminales, se puede utilizar la tecnología TVA, con la que los vectores RCAS 5,10 derivados del virus de la leucosis aviar o los vectores lentivirales pseudotipados11 infectan selectivamente las células que expresan TVA en ratones que portan un transgén tva bajo el control de un promotor específico del tipo celular, como un promotor que está activo solo en células madre 6 o ciertos progenitores 6, 7 o células alveolares8 o células activas de la vía Wnt9.
Este protocolo presenta la técnica de introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias mediante inyección intraductal de un vector viral. A continuación, se demuestra la detección de la expresión de los genes introducidos y las lesiones hiperplásicas y tumores resultantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo demuestra la técnica de inyección intraductal viral para introducir genes en células epiteliales mamarias de ratón para modelar el cáncer de mama esporádico. Por lo general, se inyectan ratones de al menos 5 semanas o más para que el proceso oncogénico comience después de que se desarrolle la glándula mamaria. Además, la abertura del pezón de ratones menores de 5 semanas de edad es a menudo demasiado pequeña para la inyección. Por otro lado, los pezones de ratones muy viejos a veces se degene…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Gary Chamness por sus útiles comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa (DOD) CDMRP BC191649 (YL) y BC191646 (YL), así como los Institutos Nacionales de Salud (NIH) CA271498 (YL). Los autores desean agradecer a la Instalación Central de Patología del Centro de Mama respaldada por SPORE P50CA186784, y al Núcleo de Citometría y Clasificación Celular respaldado por CPRIT-RP180672, NIH CA125123 y RR024574 con la ayuda de Joel M. Sederstrom.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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