In vivo Livraison de gènes dans des cellules épithéliales mammaires de souris par injection intracanalaire mammaire
Summary
Le présent protocole décrit l’injection intracanalaire de vecteurs viraux via la tétine pour délivrer des gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires.
Abstract
Les glandes mammaires de souris comprennent des arbres canalaires, qui sont tapissés de cellules épithéliales et ont une ouverture à l’extrémité de chaque mamelon. Les cellules épithéliales jouent un rôle majeur dans la fonction de la glande mammaire et sont à l’origine de la plupart des tumeurs mammaires. L’introduction de gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires de souris est une étape critique dans l’évaluation de la fonction des gènes dans les cellules épithéliales et la génération de modèles de tumeurs mammaires de souris. Cet objectif peut être atteint par l’injection intracanalaire d’un vecteur viral transportant les gènes d’intérêt dans l’arbre canalaire mammaire de la souris. Le virus injecté infecte ensuite les cellules épithéliales mammaires, apportant les gènes d’intérêt. Le vecteur viral peut être lentiviral, rétroviral, adénoviral, ou viral associé à l’adénovirus (AAV). Cette étude démontre comment un gène d’intérêt est délivré dans les cellules épithéliales mammaires par injection intracanalaire mammaire de souris d’un vecteur viral. Un lentivirus porteur de la GFP est utilisé pour montrer l’expression stable d’un gène délivré, et un rétrovirus porteur d’Erbb2 (HER2 / Neu) est utilisé pour mettre en évidence des lésions hyperplasiques atypiques induites par l’oncogène et des tumeurs mammaires.
Introduction
Les cellules épithéliales des glandes mammaires jouent un rôle majeur dans la fonction de ces glandes et sont la principale cellule d’origine du cancer du sein. Les études sur la biologie de la glande mammaire et la tumorigenèse nécessitent souvent la livraison de gènes d’intérêt dans ces cellules. Chaque glande mammaire de souris comprend un arbre canalaire bordé de cellules épithéliales avec une seule ouverture à l’extrémité du mamelon. Cette structure rend les cellules épithéliales mammaires facilement accessibles aux vecteurs viraux, qui peuvent être délivrés dans la lumière d’un arbre canalaire par injection intracanalaire1.
La technique d’injection intracanalaire mammaire était à l’origine utilisée pour des animaux beaucoup plus gros tels que les chèvres, les lapins et les rats1. Pour un animal beaucoup plus petit comme les souris, l’injection intracanalaire nécessite de nombreux outils délicats et plus de pratiques de la part des opérateurs. Il existe deux approches pour l’injection intracanalaire chez la souris. L’un est l’injection de trayons1. Une autre est l’injection directe du canal primaire de la glande mammaire #3 ou #4 après une exposition chirurgicale1. Étant donné que la première est non invasive et plus rapide une fois que l’opérateur a été bien formé, cette technique est plus couramment utilisée et sera décrite en détail dans cet article.
Par rapport aux modèles murins transgéniques traditionnels largement utilisés, dans lesquels le gène d’intérêt est introduit au stade des œufs fécondés par microinjection 2,3,4, l’administration de gènes par la méthode d’injection intracanalaire du virus présente de nombreux avantages, notamment: (1) elle évite le processus fastidieux de fabrication d’une lignée de souris transgénique pour chaque gène d’intérêt; 2° elle évite une altération potentielle du développement normal des glandes mammaires imposée par le gène d’intérêt; (3) il introduit le gène d’intérêt à tout moment désiré après la naissance; (4) il peut facilement co-introduire plus d’un gène d’intérêt; (5) il imite mieux le processus tumorigène naturel parce que les cellules infectées et donc porteuses d’oncogènes sont entourées de cellules normales; et (6) en combinaison avec la technologie TVA (tumor virus A, une protéine de surface des cellules aviaires et le récepteur du vecteur RCASrétroviral) 5, le gène d’intérêt peut être introduit dans une population cellulaire spécifique pour étudier l’origine cellulaire de la tumorigenèse et effectuer des essais de traçage de la lignée cellulaire dans les glandes mammaires 6,7,8, 9.
Tout vecteur dérivé du rétrovirus10, du lentivirus 11,12, de l’adénovirus 13 et du virus associé à l’adénovirus (AAV)14 peut être utilisé pour l’administration intracanalaire de matériel génétique. Les vecteurs rétrovirus et lentivirus s’intègrent de façon permanente dans le génome de l’hôte; Ainsi, ils introduisent des gènes d’intérêt de manière stable dans les cellules épithéliales mammaires. Alors que le lentivirus peut s’intégrer dans le génome de n’importe quelle cellule qu’il rencontre15, l’intégration génomique efficace du rétrovirus nécessite la prolifération des cellules cibles16. Les vecteurs adénoviraux et AAV ne s’intègrent pas dans le génome des cellules infectées et, par conséquent, n’expriment que transitoirement le gène d’intérêt17,18. Cette caractéristique peut être un avantage lorsque le gène d’intérêt n’a besoin d’être exprimé que pendant une courte période, comme Cre, pour supprimer un gène suppresseur de tumeur floxed.
Le lentivirus, l’adénovirus et l’AAV infectent toutes les cellules de souris qu’ils rencontrent. Mais comme l’épithélium luminal est en grande partie isolé de la couche basale sous-jacente, qui est en outre séparée du stroma par la membrane basale, l’injection intracanalaire limite l’infection en grande partie aux cellules épithéliales luminales, la cellule primaire d’origine du cancer du sein. Dans cette couche épithéliale luminale, il existe également des sous-types cellulaires distincts, notamment des cellules souches, des cellules progénitrices et plusieurs groupes de cellules différenciées. Pour infecter des sous-ensembles cellulaires spécifiques au sein de la population de cellules luminales, la technologie TVA peut être utilisée, avec laquelle les vecteurs RCAS dérivés du virus de la leucose aviaire5,10 ou les vecteurs lentiviraux pseudotypés11 infectent sélectivement les cellules qui expriment la TVA chez les souris porteuses d’un transgène tva sous le contrôle d’un promoteur spécifique au type cellulaire, tel qu’un promoteur actif uniquement dans les cellules souches 6 ou certains progéniteurs 6, 7 ou cellules alvéolaires8 ou cellules actives de la voie Wnt9.
Ce protocole présente la technique d’introduction de gènes d’intérêt dans les cellules épithéliales mammaires par injection intracanalaire d’un vecteur viral. La détection de l’expression des gènes introduits et des lésions hyperplasiques et tumeurs qui en résultent est alors démontrée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article démontre la technique d’injection intracanalaire virale pour introduire des gènes dans les cellules épithéliales mammaires de souris pour modéliser le cancer du sein sporadique. Habituellement, des souris d’au moins 5 semaines ou plus sont injectées afin que le processus oncogénique commence après le développement de la glande mammaire. En outre, l’ouverture du mamelon des souris de moins de 5 semaines est souvent trop petite pour l’injection. D’autre part, les mamelons de souris très âg?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Gary Chamness pour ses commentaires utiles sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le CDMRP BC191649 (YL) et le BC191646 (YL) du ministère de la Défense (DOD) ainsi que par les National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Les auteurs tiennent à remercier le Breast Center Pathology Core Facility soutenu par SPORE P50CA186784, et le Cytometry and Cell Sorting Core soutenu par CPRIT-RP180672, NIH CA125123 et RR024574 avec l’aide de Joel M. Sederstrom.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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