In vivo Consegna genica nelle cellule epiteliali mammarie di topo attraverso l'iniezione intraduttale mammaria
Summary
Il presente protocollo descrive l’iniezione intraduttale di vettori virali attraverso la tettarella per fornire geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie.
Abstract
Le ghiandole mammarie del topo comprendono alberi duttali, che sono rivestiti da cellule epiteliali e hanno un’apertura sulla punta di ciascun capezzolo. Le cellule epiteliali svolgono un ruolo importante nella funzione della ghiandola mammaria e sono l’origine della maggior parte dei tumori mammari. L’introduzione di geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie di topo è un passo fondamentale nella valutazione della funzione genica nelle cellule epiteliali e nella generazione di modelli di tumore mammario di topo. Questo obiettivo può essere raggiunto attraverso l’iniezione intraduttale di un vettore virale che trasporta i geni di interesse nell’albero duttale mammario del topo. Il virus iniettato successivamente infetta le cellule epiteliali mammarie, portando i geni di interesse. Il vettore virale può essere lentivirale, retrovirale, adenovirale o virale associato all’adenovirus (AAV). Questo studio dimostra come un gene di interesse viene consegnato nelle cellule epiteliali mammarie attraverso l’iniezione intraduttale mammaria di topo di un vettore virale. Un lentivirus che trasporta GFP viene utilizzato per mostrare un’espressione stabile di un gene consegnato e un retrovirus che trasporta Erbb2 (HER2 / Neu) viene utilizzato per dimostrare lesioni iperplastiche atipiche indotte da oncogeni e tumori mammari.
Introduction
Le cellule epiteliali delle ghiandole mammarie svolgono un ruolo importante nella funzione di queste ghiandole e sono la principale cellula di origine del cancro al seno. Gli studi sulla biologia della ghiandola mammaria e sulla tumorigenesi spesso richiedono la consegna di geni di interesse in queste cellule. Ogni ghiandola mammaria di topo comprende un albero duttale fiancheggiato da cellule epiteliali con una singola apertura sulla punta del capezzolo. Questa struttura rende le cellule epiteliali mammarie facilmente accessibili ai vettori virali, che possono essere consegnati nel lume di un albero duttale tramite iniezione intraduttale1.
La tecnica dell’iniezione intraduttale mammaria è stata originariamente utilizzata per animali molto più grandi come capre, conigli e ratti1. Per un animale molto più piccolo come i topi, l’iniezione intraduttale ha bisogno di molti strumenti delicati e più pratiche degli operatori. Esistono due approcci per l’iniezione intraduttale del topo. Uno è l’iniezione up-the-teat1. Un altro è l’iniezione diretta del dotto primario della ghiandola mammaria #3 o #4 dopo l’esposizione chirurgica1. Poiché il primo è non invasivo e più veloce una volta che l’operatore è stato ben addestrato, questa tecnica è più comunemente utilizzata e verrà descritta in dettaglio in questo articolo.
Rispetto ai modelli murini transgenici tradizionali ampiamente utilizzati, in cui il gene di interesse viene introdotto nella fase di ovuli fecondati attraverso la microiniezione 2,3,4, la consegna genica attraverso il metodo di iniezione intraduttale del virus presenta molti vantaggi, tra cui: (1) evita il lungo processo di creazione di una linea di topo transgenico per ciascun gene di interesse; (2) evita potenziali compromissioni del normale sviluppo delle ghiandole mammarie imposte dal gene di interesse; (3) introduce il gene di interesse in qualsiasi momento desiderato dopo la nascita; (4) può facilmente co-introdurre più di un gene di interesse; (5) imita meglio il naturale processo tumorigenico perché le cellule infette e quindi portatrici di oncogeni sono circondate da cellule normali; e (6) in combinazione con la tecnologia TVA (virus tumorale A, una proteina di superficie delle cellule aviarie e il recettore per il vettore RCAS retrovirus)5, il gene di interesse può essere introdotto in una specifica popolazione cellulare per studiare l’origine cellulare della tumorigenesi e condurre saggi di tracciamento della linea cellulare nelle ghiandole mammarie 6,7,8, 9.
Qualsiasi vettore derivato da retrovirus10, lentivirus 11,12, adenovirus13 e virus associato all’adenovirus (AAV)14 può essere utilizzato per la consegna intraduttale di materiale genetico. I vettori di retrovirus e lentivirus si integrano permanentemente nel genoma dell’ospite; Pertanto, introducono geni di interesse stabilmente nelle cellule epiteliali mammarie. Mentre il lentivirus può integrarsi nel genoma di qualsiasi cellula che incontra15, l’efficiente integrazione genomica del retrovirus richiede la proliferazione delle cellule bersaglio16. I vettori adenovirali e AAV non si integrano nel genoma delle cellule infette e, quindi, esprimono solo transitoriamente il gene di interesse17,18. Questa caratteristica può essere un vantaggio quando il gene di interesse deve essere espresso solo per un breve periodo di tempo, come Cre, per eliminare un gene oncosoppressore floxato.
Lentivirus, adenovirus e AAV infettano tutte le cellule di topo che incontrano. Ma poiché l’epitelio luminale è in gran parte isolato dallo strato basale sottostante, che è ulteriormente separato dallo stroma dalla membrana basale, l’iniezione intraduttale limita l’infezione in gran parte alle cellule epiteliali luminali, la cellula primaria di origine del cancro al seno. All’interno di questo strato epiteliale luminale, ci sono anche sottotipi cellulari distinti, tra cui cellule staminali, cellule progenitrici e diversi gruppi di cellule differenziate. Per infettare sottogruppi cellulari specifici all’interno della popolazione cellulare luminale, può essere utilizzata la tecnologia TVA, con la quale i vettori RCAS 5,10 derivati dal virus della leucosi aviariao i vettori lentivirali pseudotipizzati11 infettano selettivamente le cellule che esprimono TVA in topi portatori di un transgene tva sotto il controllo di un promotore specifico del tipo di cellula, come un promotore attivo solo nelle cellule staminali 6 o in alcuni progenitori 6, 7 o cellule alveolari8 o cellule attive della via Wnt9.
Questo protocollo presenta la tecnica di introduzione di geni di interesse nelle cellule epiteliali mammarie attraverso l’iniezione intraduttale di un vettore virale. Viene quindi dimostrata la rilevazione dell’espressione dei geni introdotti e delle conseguenti lesioni iperplastiche e tumori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo dimostra la tecnica di iniezione intraduttale virale per l’introduzione di geni nelle cellule epiteliali mammarie di topo per modellare il carcinoma mammario sporadico. Di solito, i topi di almeno 5 settimane o più anziani vengono iniettati in modo che il processo oncogeno inizi dopo lo sviluppo della ghiandola mammaria. Inoltre, l’apertura del capezzolo dei topi di età inferiore alle 5 settimane è spesso troppo piccola per l’iniezione. D’altra parte, i capezzoli di topi molto vecchi sono talvolta dege…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Gary Chamness per i suoi utili commenti su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Difesa (DOD) CDMRP BC191649 (YL) e BC191646 (YL), nonché dal National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Gli autori desiderano ringraziare il Breast Center Pathology Core Facility supportato da SPORE P50CA186784 e il Cytometry and Cell Sorting Core supportato da CPRIT-RP180672, NIH CA125123 e RR024574 con l’assistenza di Joel M. Sederstrom.
Materials
| Anti-HA antibody | Covance | MMS-101P | Dilution: 1 : 1000 |
| Artificial Tears | Covetrus | NDC 11695-0832-1 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525 | microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven |
| FACSCantoII | BD Biosciences | V96100899 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | |
| FUCGW lenti-virus | Self-made | N/A | See reference # 12 |
| FVB/N | The Jackson Laboratory | JAX:001800 | |
| Hamilton needle | Hamilton | 91033 | autoclaved |
| Hamilton syringe | Hamilton | 201000 | autoclaved |
| LED magnifying lamp | Intertek | 3165273 | |
| Micro dissection spring scissor | Roboz | RS-5621 | autoclaved |
| MMTV-tva | Self-made | See reference # 10 | |
| RCAS-Neu (HA) | Self-made | N/A | See reference # 10 |
| Rodent Comboanesthetic III | Veterinary Pharmacy | Veterinary prescription | 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine |
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