Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عرض توضيحي لمقايسة ألياف الحمض النووي للتحقيق في تلف الحمض النووي وديناميكيات الإصلاح التي تسببها الجسيمات النانوية

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

تساعد المنهجية في تحليل التباين في ديناميكيات تكرار الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية. يمكن اعتماد منهجيات مختلفة بناء على مستوى السمية الخلوية للمادة ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وصف لتحليل الصورة للمساعدة في تحليل ألياف الحمض النووي.

Abstract

يمكن أن يسبب التعرض للمواد النانوية إجهاد النسخ المتماثل وعدم الاستقرار الجيني في الخلايا. تعتمد درجة عدم الاستقرار على كيمياء وحجم وتركيز المواد النانوية ووقت التعرض ونوع الخلية المكشوفة. وقد استخدمت عدة أساليب راسخة لتوضيح كيفية تأثير العوامل الداخلية/الخارجية على التكرار العالمي. ومع ذلك ، فإن المقايسات على مستوى replicon ، مثل مقايسة ألياف الحمض النووي ، ضرورية لفهم كيفية تأثير هذه العوامل على بدء النسخ المتماثل ، والإنهاءات ، وتطور شوكة النسخ المتماثل. إن معرفة ذلك يسمح للمرء أن يفهم بشكل أفضل كيف تزيد المواد النانوية من فرص تثبيت الطفرة وعدم الاستقرار الجينومي. استخدمنا بلاعم RAW 264.7 كخلايا نموذجية لدراسة ديناميكيات النسخ المتماثل تحت التعرض لجسيمات أكسيد الجرافين النانوية. هنا ، نوضح البروتوكول الأساسي لفحص ألياف الحمض النووي ، والذي يتضمن وضع العلامات النبضية مع نظائر النوكليوتيدات ، وتحلل الخلية ، ونشر ألياف الحمض النووي ذات العلامات النبضية على الشرائح ، والتلوين المناعي الفلوري لنظائر النوكليوتيدات داخل ألياف الحمض النووي ، وتصوير وسيطة النسخ المتماثل داخل ألياف الحمض النووي باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتحليل الوسيط للنسخ المتماثل باستخدام برنامج التسجيل والتحليل بمساعدة الكمبيوتر (CASA).

Introduction

خلال كل دورة خلية ، يضمن تكرار الحمض النووي تكرار الجينوم بدقة1. يعتمد تكرار الكروموسومات حقيقية النواة بشكل أساسي على ثلاثة عوامل: توقيت إطلاق أصول النسخ المتماثل المتعددة ، وسرعة الشوكات التي تظهر من الأصول المطلقة ، وإنهاء عملية النسخ المتماثل عندما يلتقي شوكان متماثلان من أصول متجاورة2. من أجل نقل المعلومات الوراثية بدقة عالية إلى الخلايا الوليدة ، وكذلك الحفاظ على السلامة الوراثية ، يعد تكرار الحمض النووي بدقة أمرا بالغ الأهمية. العوامل التي تتطور من التمثيل الغذائي المنتظم أو بسبب المواد البيئية الاصطناعية أو الطبيعية تهاجم الجينوم باستمرار. تتسبب هذه العوامل الداخلية والخارجية في إبطاء أو توقف شوكات النسخ المتماثل بسبب مواجهة تلف الحمض النووي الناجم عن هذه العوامل ، وتسمى الشوكات التي تتباطأ مؤقتا أو تتوقف استجابة لهذه الصعوبات إجهاد النسخ المتماثل3. استجابة لإجهاد النسخ المتماثل ، طورت الخلايا العديد من المسارات الجزيئية التي تحافظ على استقرار شوكات النسخ المتماثل المضطربة وتسمح لها بإعادة التشغيل4. من حيث الاستقرار الجيني ، وبقاء الخلايا ، والأمراض البشرية ، ظهرت آليات الاستجابة للإجهاد المتماثل هذه كعوامل رئيسية للحفاظ على جينوم صحي ، وضمان بقاء الخلية ، وتقليل احتمالية تكوين المرض5.

أحد العوامل الخارجية القادرة على إنتاج إجهاد النسخ المتماثل هو الجسيمات النانوية. الجسيمات النانوية هي جسيمات يتراوح حجمها من 1 نانومتر إلى 100 نانومتر6. نظرا لمساحات سطحها العالية وأشكالها المميزة وخصائصها الكيميائية الفريدة ، تستخدم الجسيمات النانوية في مختلف التطبيقات الطبية والصيدلانية والبيئية والصناعية 7,8. في حين أن الجسيمات النانوية لها الكثير من الفوائد المحتملة ، فإن بعضها (بسبب طبيعتها الموروثة أو طول عمرها) يمكن أن يصبح ساما. يمكن أن تتشكل الجسيمات النانوية أيضا بسبب البلى الطبيعي للغرسات الطبية ويتم إطلاقها في المنطقة المحيطة بالأطراف الاصطناعية 9,10.

نظرا لتعرض البشر لعدد لا يحصى من الجسيمات النانوية المنتجة لتطبيقات مختلفة ، زادت الأبحاث في مجال سمية الجسيمات النانوية بشكل كبير خلال السنوات العشر الماضية11. في حين أن هذه الجهود البحثية قد كشفت عن معلومات وفيرة حول التهديد المحتمل الذي تشكله الجسيمات النانوية على صحة الإنسان ، فإن المعرفة حول إمكانية تسبب الجسيمات النانوية في السمية الجينية لا تزال محدودة. ما تم اكتشافه حتى الآن هو أن هذه الجسيمات النانوية يمكن أن تتفاعل جسديا مع الحمض النووي ، وتعزز تلف الحمض النووي ، وتتلف أو تتداخل مع البروتينات المسؤولة عن إصلاح أو تكرار الحمض النووي12. للكشف عن كيفية تداخلها مع تكرار الحمض النووي ، عادة ما يتم استخدام تمشيط ألياف الحمض النووي ، وتخليق الحمض النووي المقاوم للإشعاع (RDS) ، وتحليل ألياف الحمض النووي13،14،15،16.

طريقة تمشيط ألياف الحمض النووي مرنة وتعطي معلومات حول ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل على مستوىالجزيء الواحد 17. في جوهرها ، يتم سحب غطاء مملح برفق من محلول الحمض النووي بمجرد أن ترتبط أطراف الحمض النووي به. تستقيم جزيئات الحمض النووي (DNA) وتصطف بواسطة السطح الهلالي للمحلول. يدعم تجانس وتباعد ومحاذاة ألياف الحمض النووي قياسات دقيقة ويمكن الاعتماد عليها لطول مجرى الألياف. من خلال ضبط طول وتسلسل العلاجات والأدوية المستخدمة للتسبب في الإجهاد أو الضرر ، يمكن مراقبة العديد من جوانب تقدم الشوكة باستخدام هذا التطبيق. في هذه الطريقة ، يتم استخدام نظام وضع العلامات المزدوج ، والذي يتم من خلاله تقييم سرعة وتقدم شوكة النسخ المتماثل17,18. من ناحية أخرى ، يستفيد الرحلان الكهربائي 2D gel من حقيقة أنه في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، تنتقل هياكل الحمض النووي المتفرعة بشكل أبطأ من جزيئات الحمض النووي الخطية من نفس الكتلة ، مما يسمح بالفصل النظيف بين الاثنين في تشغيل 2D. في الواقع ، تم فحص هذه الطريقة لفصل جزيئات الحمض النووي بناء على كتلتها في الجولة الأولى وبناء على شكلها في الجولة الثانية المتعامدة. بعد تجزئة الحمض النووي الجينومي ، تطور المواد الوسيطة غير الشائعة للتكرار وإعادة التركيب شكلا متفرعا ، ويمكن تمييزها عن الجزيئات الخطية الأكثر شيوعا في 2D gel19.

تستخدم طريقة RDS لتحديد كيفية تأثر تخليق الحمض النووي العالمي. في هذه الطريقة ، يتم تحديد درجة تثبيط التكرار العالمي من خلال مقارنة كمية النيوكليوتيدات المدمجة ذات العلامات الإشعاعية ، مثل [14C] ثيميدين ، في الخلايا غير المعالجة مقابل الخلايا المعالجة14,20. تمثل النسبة المئوية للفرق في وضع العلامات الإشعاعية بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة الدرجة التي يؤثر بها العامل المدمر للحمض النووي على تخليق الحمض النووي. على غرار ذلك ، تستخدم طريقة أخرى قدرة الخلايا على دمج نظائر النوكليوتيدات مثل BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) لقياس التدفق الخلوي لقياس المعدلات الإجمالية لتخليق الحمض النووي21,22. في حين أن هذه الطرق توضح كيف تؤثر العوامل الضارة بالحمض النووي على تخليق الحمض النووي العالمي ، إلا أنها لا تظهر كيف تتأثر التكرارات الفردية. في الواقع ، تعد المقايسات على مستوى replicon ضرورية لفهم أفضل لبدء ومدى عدم الاستقرار الجيني في حالة التعرض للجسيمات السامة (المواد النانوية). التصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي والمجهر الإلكتروني هي بعض الطرق المستخدمة لتحديد هذا23،24،25،26.

تم تطوير مفاهيم فقاعات النسخ المتماثل والنسخ المتماثل ثنائي الاتجاه من مصادر متباعدة بشكل متساو لأول مرة باستخدام اختبارات أحادية الجزيء مثل المجهر الإلكتروني والتصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي27,28. يتم تسهيل المراقبة المباشرة لوسيطات النسخ المتماثل المتفرعة على جزيئات محددة منتشرة عبر شبكة مغلفة بالكربون بشكل كبير بواسطة المجهر الإلكتروني. تم استخدام هذه الطريقة ، التي لا تزال قيد الاستخدام حتى اليوم لتتبع التحولات المرضية في شوكات النسخ المتماثل ، لتحديد أول أصل حقيقي النواة لتكرار الحمض النووي28. يتمحور التصوير الشعاعي الذاتي للألياف حول مفهوم التحديد الشعاعي الذاتي للمناطق المكررة حديثا ووضع علامات نبضية على الكروموسومات باستخدام الثيميدين الثلاثي. أصبح التقييم الكمي الأول لكثافات الأصل ومعدلات شوكة النسخ المتماثل في التسلسلات الجينومية الميتازوان ممكنا من خلال التصوير الشعاعي الذاتي لألياف الحمض النووي29.

حاليا ، حلت طرق التصوير الفلوري للألياف محل التصوير الشعاعي الذاتي ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن التصوير الفلوري للألياف أسرع بكثير من التصوير الشعاعي الذاتي. في التصوير الفلوري للألياف ، يتم دمج اثنين من مشتقات النوكليوتيدات المهلجنة ، مثل البرومو- (Br) أو الكلورو- (Cl) أو iododeoxyuridine (IdU) ، بالتتابع في الحمض النووي المكرر حديثا ثم يتم تحديدهما عن طريق التألق المناعي غير المباشر باستخدام الأجسام المضادة30. أصبح العرض المجهري للحمض النووي الناشئ الذي دمج أحد النظائر أو كليهما ممكنا عن طريق تلطيخ أحد النظائر بلون واحد والتناظرية الأخرى بلون مختلف (على سبيل المثال ، الحمض النووي الناشئ المناعي مع IdU الأحمر المدمج والأخضر CldU المدمج) (الشكل 1) 21. يمكن التعرف على العديد من الأنواع المختلفة من وسيطة النسخ المتماثل عن طريق تحليل ألياف الحمض النووي. الأكثر شيوعا التي تمت دراستها هي شوكات الاستطالة الفردية ، والبدء ، والإنهاءات. الشوكات الاستطالة الفردية لها نمط تكرار من اللون الأحمر متبوعا باللون الأخضر (أحمر-أخضر; الشكل 2 أ). 13 كثيرا ما تستخدم أطوال هذه المواد الوسيطة لقياس سرعة الشوكة (أي طول الشوكة / وقت النبض) أو التدهور الخارجي للحمض النووي الوليد من خلال تقصير المسار (الشكل 2E) 30،31،32. في دراسة أجراها Mimitou et al. ، وجد أنه عند التعرض طويل الأمد لهيدروكسي يوريا ، وهو سم تكرار يسبب فواصل مزدوجة في الحمض النووي ، تم تجنيد RE1133. MRE11 هو exonuclease معروف بنشاطه exonuclease 3'-5 ، وهو قادر على قطع نهايات الحمض النووي للإصلاح. لذلك ، عند التعرض للعوامل السامة ، يمكن للمرء أن يلاحظ تدهور التحلل الخارجي للحمض النووي الوليد ، وهو تقصير شريط الحمض النووي بسبب التعرض لعامل مدمر للحمض النووي34.

قد تؤدي كسور شوكة النسخ المتماثل الناتجة عن العوائق الفيزيائية (معقدات بروتين الحمض النووي أو آفات الحمض النووي) أو العوائق الكيميائية أو الطفرات إلى إيقاف النسخ المتماثل وتتطلب إعادة التركيب المتماثل لإعادة تشغيله. يعرف هذا باسم ضعف تقدم الشوكة. أشارت العديد من التحقيقات في المختبر وفي الجسم الحي إلى أن النسخ قد يمنع ، في بعض الأحيان ، تقدم شوكة النسخ المتماثل بهذه الطريقة35.

البدايات هي أصول النسخ المتماثل التي تبدأ وتطلق أثناء النبضة الأولى أو الثانية. الأصول التي تطلق أثناء النبضة الأولى ولها شوكات تكرار تستمر في النشاط لها نمط أخضر-أحمر-أخضر (الشكل 2B ، أقل). الأصول التي تبدأ خلال النبضة الثانية لها نمط أخضر فقط (الشكل 2B ، العلوي) وتسمى أحيانا الأصول التي بدأت حديثا ، لذلك يمكن تمييز هذه الأصول عن تلك التي تبدأ أثناء النبضة الأولى. تسمح مقارنة النسب المئوية النسبية للأصول التي تم إطلاقها حديثا بين حالتين تجريبيتين للمرء بفهم كيفية استجابة الخلية لعامل مدمر للحمض النووي أو وجود أو عدم وجود بروتين. يتم إنشاء الإنهاءات عندما يتم دمج شوكتين متماثلتين من replicons المجاورة ، ويكون لهما نمط أحمر-أخضر-أحمر (الشكل 2D)30.

بناء على الحقائق الموضحة أعلاه ، يعتبر تحليل ألياف الحمض النووي حاليا طريقة مفضلة لدراسة الاختلاف في ديناميكيات تكرار الحمض النووي الناجم عن العوامل السامة مثل المواد النانوية. أصبح لدى الباحثين الآن فهم ومعرفة جيدان لديناميات تكرار الحمض النووي على مستوى الجينوم في حقيقيات النوى ، من الناحيتين الكمية والنوعية ، بسبب اكتشاف هذه التكنولوجيا36. واستنادا إلى متغيرات النتائج، يمكن اعتماد عدة منهجيات. يوضح الشكل 3 بعض الأمثلة على طرق دراسة الاختلافات في تلف الحمض النووي الناجم عن العوامل الخارجية / الجسيمات النانوية. الهدف العام من طريقة تحليل ألياف الحمض النووي الموصوفة في هذه الدراسة هو تحديد كيفية تأثير الجسيمات النانوية على عملية النسخ المتماثل في المختبر وكيف تؤثر بشكل تفاضلي على الأنسجة المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الأجسام المضادة والعازلة

  1. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي ، والماوس المضاد ل BrdU عند تخفيف 1: 300 في 5٪ BSA والفئران المضادة ل BrdU عند تخفيف 1: 500 في 5٪ BSA.
  2. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوي ، alexafluor 594 الأرنب المضاد للفأر بتخفيف 1: 300 في 5٪ BSA و alexafluor 488 دجاج مضاد للفئران بتخفيف 1: 500 في 5٪ BSA.
  3. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثلاثية ، alexafluor 594 الماعز المضاد للأرانب بتخفيف 1: 1,000 في 5٪ BSA و alexafluor 488 الماعز المضاد للدجاج بتخفيف 1: 1,000 في 5٪ BSA.
  4. تحضير 10 مل من المخزن المؤقت للتحلل في ddH 2 O مع2مل من 1M Tris (درجة الحموضة 7.4) ، 1 مل من 0.5 M EDTA ، و 0.5 مل من 10٪ SDS.

2. التحضير لفحص الألياف

  1. اليوم 1: زراعة الخلايا ومعالجة المواد النانوية لفحص الألياف
    1. لوحة RAW 264.5 خلايا البلاعم أو الخلايا ذات الاهتمام ، بحيث تكون الخلايا في مرحلة لوغاريتم نموها في يوم التجربة. بالنسبة لخلايا RAW ، أضف 5 × 104 خلايا / بئر إلى 24 لوحة بئر لكل حالة. الحفاظ على الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 98٪ رطوبة. يصف الجدول 1 مكونات الوسائط المستخدمة. اسمح للخلايا بالنمو إلى التقاء 75٪ -80٪17,37.
    2. بعد أن تصل الخلايا إلى مستوى التقاء 75٪ -80٪ ، قم بإزالة الوسط من الألواح ، وخذ نصف الوسط واحتفظ به لنبض CldU (احتياطي CldU) ، وأضف 5 ميكرولتر IdU إلى النصف الآخر بتركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومتر. امزج وأضف الوسط المحتوي على IdU مرة أخرى إلى اللوحات. ضع الخلايا مع IdU في الحاضنة لمدة 20 دقيقة.
    3. ضع وسط احتياطي CldU على حرارة 37 درجة مئوية لإبقائه دافئا مسبقا. أضف CldU إلى هذا الوسيط قبل نبض CldU مباشرة.
    4. بعد 20 دقيقة ، قم بشفط خليط IdU المتوسط ، واغسل الخلايا برفق باستخدام 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4) عن طريق تدوير اللوحة برفق. تجاهل برنامج تلفزيوني.
    5. عالج الخلايا بتركيزات مختلفة من الجسيمات النانوية في 500 ميكرولتر من الوسط ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة أخرى. في هذه الدراسة ، استخدم جسيمات أكسيد الجرافين النانوية المعالجة بتركيز 25 ميكروغرام / مل.
    6. نضح خليط العلاج المتوسط ، واغسل الخلايا برفق باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق تدوير اللوحة برفق. تجاهل برنامج تلفزيوني. أضف 5 ميكرولتر من CldU (نهائي 100 ميكرومتر
    7. تركيز) إلى وسط احتياطي CldU ، وتغطية الخلايا بوسط احتياطي CldU. ضع الخلايا في الحاضنة لمدة نبض CldU لمدة 20 دقيقة.
    8. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، أو كشطها أو تربسينيز لمدة 3-4 دقائق ، ثم أضف 5 مل من الوسط إلى اللوحة ، واجمع الخلايا.
    9. تدور في 264 × غرام لمدة 4 دقائق. قم بإزالة الوسط ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني بارد. حدد أرقام الخلايا باستخدام مقايسة تريبان الزرقاء (عد مقياس الدم) ، ثم قم بتخفيف الخلايا إلى ~ 200-400 خلية / ميكرولتر. حافظ على تعليق الخلية على الجليد أثناء عد الخلايا.
      ملاحظة: إذا أمكن ، حدد الوقت الذي تجلس فيه الخلايا على الجليد. قد يساعد ذلك في الحصول على حبة من محلول الخلية على طول الجزء العلوي من الشريحة. إذا تم الاحتفاظ بها على الجليد ، احتفظ بها لمدة تقل عن 30 دقيقة.
  2. اليوم 1: تحضير ألياف الحمض النووي
    1. باستخدام قلم رصاص ، قم بتسمية الشرائح (شريحة زجاجية ، 75 مم × 25 مم) بالحالة التجريبية والتاريخ.
    2. خذ 2 ميكرولتر من الخلايا في ماصة ، وأمسك الماصة بزاوية ~ 45 درجة ، وضع الماصة حوالي 1 سم أسفل ملصق الشريحة ، وانقل الماصة أفقيا إلى ملصق الشريحة. عندما تتحرك الماصة عبر الشريحة ، حرر القليل من محلول الخلية في كل مرة. إنشاء أسطر متعددة من الخلايا في كل شريحة (خطوة حرجة).
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك خط أفقي لتعليق الخلية عبر الشريحة. إذا كان تعليق الخلية يرتفع ، فقم بإضافة 5-10 ميكرولتر من وسط الخلية إلى الحاوية التي تحتوي على تعليق الخلية ، لأن هذا قد يساعد المحلول على الالتصاق بالشريحة عند تطبيقه مرة أخرى.
    3. دع المحلول مع الخلايا يتبخر حتى يبدو المحلول لزجا ومبتذلا. عند هذه النقطة ، يرتبط بعض السائل بالخلايا ، ولكن ليس كثيرا. تستغرق هذه الخطوة من 8 إلى 20 دقيقة وتختلف حسب مقدار الرطوبة في الهواء.
      ملاحظة: تأكد من أن كل المحلول لم يتبخر ، لأن هذا يجعل من الصعب جدا الحصول على ألياف الحمض النووي المستقيمة والمحاذاة لأن معظم الحمض النووي ، إن لم يكن كله ، سيكون عالقا معا وغير قادر على الانفصال.
    4. عندما يكون المحلول مبتذلا ، قم بتراكب الخلايا ب 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانتشار (التحلل) لكل سطر من الخلايا ، مع الحرص على عدم ترك طرف الماصة يلمس الشريحة. انتظر لمدة 10 دقائق. قم بإمالة الشريحة بزاوية 25 درجة ، وضع ملصق الشريحة أفقيا على حافة حامل الأنبوب (يجب أن يصطف الجزء السفلي من الملصق مع حافة حامل الأنبوب).
    5. اترك انتشار الحمض النووي يجف في الهواء لمدة لا تقل عن 4 ساعات من وقت عمل الشرائح الأخيرة.
      ملاحظة: فترة من 4 ساعات إلى 12 ساعة جيدة للتجفيف. ومع ذلك ، لا تدعها تجف بين عشية وضحاها. إذا سمح له بالجفاف طوال الليل ، فسيكون هناك الكثير من الحمض النووي المريح ولكن القليل جدا من ألياف الحمض النووي المستقيمة والمحاذية.
  3. اليوم 1: تثبيت ألياف الحمض النووي والتجميد
    1. بمجرد أن تجف الشرائح ، قم بإصلاح الشرائح بالميثانول: حمض الخليك (3: 1) عن طريق غمر الشرائح لمدة دقيقتين. قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة ، واترك الشرائح تجف طوال الليل في منطقة ذات تعرض محدود للضوء ، أو قم بتغطية الشرائح بخيمة من رقائق القصدير.
  4. اليوم 2
    1. ضع الشرائح في حامل شرائح زجاجي. ضع الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. تعمل هذه الخطوة على تحسين دقة الصورة أو هشاشتها.

3. إجراء فحص ألياف الحمض النووي

  1. تمسخ الحمض النووي
    1. قم بإعداد غرفة مرطبة باستخدام صناديق طرف ماصة صغيرة مع أغطية. املأ الحاويات بالماء نصفها وضعها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
    2. أخرج الشرائح من -20 درجة مئوية ، وقم بإذابة الثلج عنها لبضع ثوان. ضع الشرائح بعناية في برطمان كوبلين يحتوي على ماء منزوع الأيونات (DI) حتى لا تلمس الأسطح المطلية جدران البرطمان. احتضان الشريحة لمدة 20 ثانية ، ثم اسكب الماء بعناية.
    3. أضف 2.5 متر حمض الهيدروكلوريك إلى جرة كوبلين بحيث تغطي جميع الشرائح. انتظر لمدة 80 دقيقة. هذه خطوة حاسمة في البروتوكول. يمكن أن يؤدي التغيير في الوقت إلى تغيير نتيجة الصورة.
    4. اغسل الشرائح 1x باستخدام PBS plus Tween (PBS + 0.1٪ Tween [التركيز النهائي]) ثم 2x مع PBS لمدة 3 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تلطيخ مناعي
    1. احتفظ بالشرائح في الغرفة المرطبة للخطوات التالية. قم بحظر الشرائح بنسبة 5٪ من BSA في PBS لمدة 30 دقيقة في RT ، وقم بتغطيتها بأغطية أو قسائم تغطية مصنوعة من كيس لطخة غربي أو أغطية بلاستيكية شفافة.
    2. بعد الحجب ، قم بإزالة الغطاء بعناية ، وإزالة محلول الحظر ، ومسح الشريحة على منشفة ورقية (اضغط على الشريحة الموجودة على المنشفة) لإزالة محلول الحجب الزائد.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي على طول الشريحة. أضف غطاء بلاستيكي جديد ، وانتظر لمدة 2 ساعة. عند إضافة قسيمة الغطاء ، تأكد من عدم تشكل فقاعات.
    4. بعد ساعتين ، تخلص من محلول الأجسام المضادة ، واشطف الشرائح في جرة كوبلين مملوءة ب PBS 2x في RT. استخدم برنامج تلفزيوني جديد في كل مرة لغسل الشرائح.
    5. قم بحظر الشرائح مرة أخرى عن طريق إضافة 200 ميكرولتر (ثلاث إلى أربع قطرات) من 5٪ BSA على طول كل شريحة ، وإضافة غطاء بلاستيكي. انتظر لمدة 15 دقيقة.
    6. انزع الغطاء ، واضرب BSA الزائد على منشفة ورقية ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على طول الشريحة. أضف غطاء بلاستيكيا جديدا ، وانتظر لمدة 1 ساعة.
    7. انزع قسيمة الغطاء ، وتخلص من BSA الزائد على منشفة ورقية ، واغسل الشرائح 2x في PBS في RT.
    8. قم بحظر الشرائح مرة أخرى عن طريق إضافة 200 ميكرولتر (ثلاث إلى أربع قطرات) من 5٪ BSA على طول كل شريحة ، وإضافة غطاء بلاستيكي. انتظر لمدة 15 دقيقة.
    9. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة غطاء الغطاء ، وإزالة BSA الزائد على منشفة ورقية ، وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثالثية على طول الشريحة. أضف أغطية بلاستيكية جديدة ، وانتظر لمدة 30 دقيقة.
    10. اغسل الشرائح باستخدام PBS 3x. قم بإزالة PBS الزائد ، واتركه يجف تماما.
    11. بمجرد أن يجف ، أضف وسيط التثبيت ، وضع أغطية زجاجية بعناية (24 مم × 60 مم) فوق وسط التثبيت حتى يتم تجنب الفقاعات. أعد تسمية الشرائح واتركها في الظلام طوال الليل.

4. الحصول على الصور

  1. تصور ألياف الحمض النووي الملطخة بالمناعة باستخدام مجهر مناعي مزود بكاميرا وهدف 60x ومجموعات مرشحات مناسبة للكشف عن أصباغ alexafluor 488 و 594.
  2. التقط صورا للتحليل في المناطق التي تكون فيها الألياف مفصولة جيدا وغير متشابكة. من المهم التقاط الصور في مناطق مختلفة على طول الشريحة، لأن التقاط الصور في جزء واحد فقط من الشريحة قد لا يوفر بيانات تمثيلية فيما يتعلق بجميع وسيطات النسخ المتماثل الموجودة على الشريحة.
  3. إذا أمكن ، احصل على صور الألياف من 20 منطقة مختلفة على شريحة. استخدم قناة واحدة فقط لتحديد مناطق التقاط الصور لتجنب التحيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد الحصول على صور كافية (من 20-100 صورة لكل حالة) ، يجب تحديد وسيطة النسخ المتماثل وقياسها وحسابها. سواء كان تحليل الألياف يدويا أو تلقائيا عبر برنامج38 ، من الضروري تحديد الخصائص التي يجب أن تتمتع بها الألياف بوضوح حتى يتم حسابها أو تسجيلها (أو عدم حسابها أو قياسها)39. على سبيل المثال ، يمكن النظر في الأسئلة التالية. (1) هل يجب قياس وحساب الألياف ذات التألق المناعي بنسبة 100٪ فقط في جميع أنحاء الألياف ، أم يمكن أن تحتوي على بعض المناطق بدون تألق مناعي (على سبيل المثال ، هل يجب تحليل جميع المواد الوسيطة في الشكل 4Ai و II و III أو مجرد مجموعة فرعية منها؟)؟ في حالة تحليل الألياف مع فقدان الإشارة ، ما هو الحد الأقصى لفقدان الإشارة المقبول داخل الألياف ، وما هو الحد الأقصى لعدد وحدات البكسل المستمرة في الألياف التي يمكن أن تكون خالية من أي إشارة (على سبيل المثال ، هل سيعتبر الشكل 3Aiv وسيطا أحمر أخضر أو أحمر فقط؟)؟ (2) ماذا يجب أن يكون الحد الأدنى والحد الأقصى لعرض / أطوال الألياف؟ (3) ماذا يجب أن تكون نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S: N) عند تحديد ما إذا كان ينبغي للمرء قياس الألياف أم لا (على سبيل المثال ، كم عدد الألياف التي يجب اختيارها في الشكل 4B لتحليلها؟)؟ (4) ما مدى قرب الألياف من حافة الصورة قبل أن لا يتم حسابها أو قياسها؟ (5) إذا كانت إشارة الفلورسنت صفراء ، فهل يحسب المرء ذلك باللون الأحمر أو الأخضر (على سبيل المثال ، هل يجب حساب الجزء الأصفر من وسيط النسخ المتماثل في الشكل 4C على أنه أحمر أو أخضر؟)؟ (6) ما هي المدة التي يجب أن تكون فيها شريحة اللون ليتم حسابها كإشارة حقيقية (على سبيل المثال ، هل وسيط النسخ المتماثل في الشكل 4D مسار أخضر فقط ، أو مسار أخضر - أحمر - أخضر ، أو مسار أخضر أحمر؟)؟ (7) إذا كنت تستخدم برنامجا آليا لتحليل الألياف ، فما مدى ثقة البرنامج في القياس / العد الذي قام به للتو؟ (8) إذا تم تحليل الألياف يدويا ، فما مدى اتساق التحليل بمرور الوقت وبين الأفراد؟

عادة ما تكون المعلمات المستخدمة لتحليل ألياف الحمض النووي كما يلي:
نسبة الإشارة إلى الضوضاء: 3 (كثافة الألياف أكبر بثلاث مرات من كثافة الخلفية)
سمك الألياف: ≤8 بكسل في العرض
الحد الأدنى للحجم: أحمر أو أخضر فقط و 10 بكسل ؛ مسارات حمراء وخضراء مع كل مقطع ≥10 بكسل ؛ مسارات حمراء - خضراء - حمراء أو خضراء - حمراء - خضراء مع كل مقطع ≥10 بكسل.
استمرارية إشارة الفلورسنت: 80٪ على الأقل ولا توجد فجوات في الإشارة أكبر من 6 بكسل.
الثقة في التقييم: يجب أن تكون قيم الثقة متشابهة مع بعضها البعض في الصورة وبين الصور.

بالإضافة إلى المعلمات المذكورة أعلاه ، هناك معيار مهم آخر وهو اختيار ألياف شفافة لا تتداخل مع الألياف الأخرى أثناء التصوير والتحليل.

يوضح الشكل 5A صورا تمثيلية للتحكم (الشكل 5Ai) والحمض النووي للبلاعم المعالج بالجسيمات النانوية لأكسيد الجرافين (الشكل 5Aii ، iii). تظهر الصورة زيادة في المسارات للقراءة فقط (الإنهاءات) وانخفاضا في الأصول التي تم إطلاقها حديثا في الخلايا المعالجة بأكسيد الجرافين مقارنة بالتحكم (الشكل 5C). من المهم أيضا مراعاة عدد الصور وموضع الشريحة التي يتم التقاط الصور منها. كما هو موضح في الشكل 5Aiii,C ، لوحظ اختلاف في نمط وسيطة النسخ المتماثل (زيادة في الأصول الجديدة مقارنة بالسيطرة) في منطقة مختلفة من نفس الحالة. على الرغم من أن بعض هذه الملاحظات قد لا تؤثر على النتيجة الإجمالية ، يجب توخي الحذر لتصوير الشريحة من خلال تضمين جميع المجالات التمثيلية. سيكون من المثالي تقسيم المساحة الإجمالية للشريحة إلى خمس إلى ست مناطق والتقاط صور متعددة من كل منطقة (على سبيل المثال: 10 صور) للعثور على بيانات ألياف قاطعة لكل شريحة. إنه مثالي لاختيار حوالي 500 وسيط (الشكل 5 ب) من شرائح / ظروف متعددة. مع هذه الاختلافات في النسخ المتماثل ، يمكن استخدام القياس الكمي الوسيط من تحليل ألياف الحمض النووي للتحقيق في الاختلاف في ديناميكيات تكرار الحمض النووي الناجم عن جسيمات أكسيد الجرافين النانوية أو السمية الجينية للمواد النانوية الأخرى. ومن ثم ، يمكن الحصول على فهم نوعي وكمي لديناميات تكرار الحمض النووي على مستوى الجينوم من خلال هذه المنهجية الجديدة مقارنة بالتحليلات الأخرى المذكورة في المقدمة.

Figure 1
الشكل 1: فحص ألياف الحمض النووي. تمثيل تخطيطي للمقايسة مع نظرة عامة على الخطوات الرئيسية في تحليل ألياف الحمض النووي. مقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التلوين المناعي لوسيطة تضاعف الحمض النووي (DNA). تمثيل تخطيطي لوسيطات النسخ المتماثل المختلفة التي تم تحديدها بواسطة وضع العلامات النبضية المتسلسلة باستخدام IdU (أحمر) و CldU (أخضر). مقياس: 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التعرض للجسيمات النانوية. منهجيات مختلفة لدراسة الاختلافات في تلف الحمض النووي الناجم عن الجسيمات النانوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: خواص ألياف الحمض النووي (DNA) المراد تسجيلها. أمثلة على النسخ المتماثل الوسيط في صورة. (أ) الثغرات في التألق المناعي؛ (ط) فقدان إشارة التألق المناعي بنسبة 0٪ عبر وسيط النسخ المتماثل ؛ (ii) ~ 7٪ فقدان الإشارة ؛ (iii) فقدان إشارة بنسبة 50٪ ؛ و (iv) فقدان إشارة >90٪. (ب) منطقة بها العديد من وسيطات النسخ المتماثل المتداخلة (يشير السهم إلى المنطقة ذات التداخل الواضح في الألياف). ج: ليف حمض نووي (DNA) ذو منطقة صفراء. (د) وسيط تكرار مفتوح للتفسير (يشير السهم إلى الفجوات الموجودة في الألياف). مقياس: 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تحليل ألياف الحمض النووي وتفسيرها. (أ) صور ألياف الحمض النووي التمثيلية من (أ) خلايا التحكم في البلاعم و(ii,iii) خلايا البلاعم المعالجة بالجسيمات النانوية لمدة 20 دقيقة بتركيز 25 ميكروغرام/مل. تم التقاط الصورتين الثانية والثالثة من مناطق مختلفة من الشريحة. (ب) تحليل البرمجيات المؤتمتة التمثيلية لظروف التحكم والمعالجة بالجسيمات النانوية. لهذا التحليل ، استخدمنا برنامج تتبع وقياس ألياف الحمض النووي الآلي الذي طوره Wang et al.38. توضح الأرقام الواردة في الشكل عدد مسارات الحمض النووي التي تم تحليلها. (ج) تمثيل بياني لتحليل البرمجيات لظروف التحكم ومعالجة الجسيمات النانوية. يمثل NP الجسيمات النانوية. يتم حساب النسبة المئوية النسبية للسكان المتوسطين (على سبيل المثال ، للأحمر فقط) من إجمالي الوسطاء الذين تم تحليلهم. بمقارنة الصورة 1 المعالجة NP بالصورة 2 ، هناك اختلافات كبيرة بين الصورتين. وبالتالي ، من المهم الحصول على العديد من الصور في جميع أنحاء الشريحة لفهم كيفية تأثير الحالة التجريبية على عملية النسخ المتماثل. الاختصارات: R = أحمر. G = أخضر. مقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التكوين الإعلامي
10٪ مصل بقري جنيني
1٪ محلول البنسلين والستربتومايسين (10000 وحدة / مل)
1٪ لتر جلوتامين (200 مللي مول)
جلوكوز النسر المعدل من Dulbecco متوسط إلى مرتفع

الجدول 1: تكوين الوسائط المستخدمة في زراعة الخلايا البلعمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نناقش هنا طريقة للمساعدة في تحليل التباين في ديناميكيات تضاعف الحمض النووي في وجود الجسيمات النانوية من خلال فحص ألياف الحمض النووي. يتم وصف الخطوات الحرجة الرئيسية المتضمنة في الفحص القياسي في البروتوكول (الخطوة 2.2.2 والخطوة 3.1.3). يوصى دائما باستخدام منطقة ذات تعرض محدود للضوء العلوي وتدفق هواء مستمر لمنع فواصل الحمض النووي الناجم عن الضوء في الشرائح وكذلك لتعزيز قابلية التكاثر. مطلوب اهتمام دقيق على المدة الزمنية لتجفيف الخلية المحللة على الشرائح. سيؤثر الإفراط في الجفاف سلبا على انتشار الألياف. الخطوة الثانية الحاسمة هي تمسخ الألياف باستخدام محلول حمضي. يجب أن تبقى مدة الغسيل الحمضي متساوية لجميع الشرائح في نفس التجربة. يوصى باستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهاتين الخطوتين للعثور على الظروف المثلى (وقت التحلل ، وحجم المحللة على الشريحة ، ووقت التجفيف ، ووقت الغسيل الحمضي) لأنواع الخلايا المختلفة وبيئات المختبر.

كما هو موضح في الشكل 3، يمكن أن تختلف مدة تعرض الجسيمات النانوية من أجل التحديد الكمي للتغير في ديناميكيات تضاعف الحمض النووي (DNA) التي تسببها الجسيمات النانوية. لتحديد التأثير الأولي لديناميات النسخ المتماثل ، سيكون التعرض قصير المدى مثل 1 دقيقة أو 20 دقيقة أو 30 دقيقة بجرعات مختلفة مناسبا. يمكن تحديد الفرق في أنماط النسخ المتماثل (كما هو موضح في الشكل 2) بعد تعرض الخلايا على المدى الطويل للمواد النانوية من خلال مقارنة أنماط التعرض ل IdU و CIdU (20 دقيقة لكل منهما) قبل وبعد معالجة الجسيمات النانوية. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد توقف الشوكة ، وتباطؤ الشوكة ، والاختلاف في إطلاق المنشأ في أوقات مختلفة من التعرض ، والتي يمكن تفسيرها على أنها آثار التعرض الحاد والمزمن للمواد النانوية39,40.

هناك العديد من التقنيات الواعدة المتاحة للكشف عن الاختلاف في تكرار الحمض النووي ، مثل تمشيط الحمض النووي وطريقة RDS. ومع ذلك ، بالمقارنة مع تلك الطرق ، فإن فحص ألياف الحمض النووي مناسب وفعال من حيث التكلفة دون الحاجة إلى أدوات باهظة الثمن للتحليل41. قيود هذه الطريقة هي المدة التجريبية ، والوقت اللازم لالتقاط صور كافية للقياس الكمي ، وكذلك تحليل البرنامج. ومع ذلك ، بالتأكيد ، سيدعم هذا النهج أبحاث السمية النانوية في تحديد عدم الاستقرار الجيني الناجم عن الجسيمات في خطوط الخلايا ، وكذلك في عينات الأنسجة المختلفة وبين الأنواع المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يقر المؤلفون بالدعم المالي المقدم من مؤسسة Blazer ، وبرنامج التكنولوجيا الحيوية الطبية في العلوم الطبية الحيوية ، و UIC Rockford ، وقسم تعليم العلوم الصحية ، UIC Rockford. يشكر المؤلفون أنانيا سانجينيني وجيمس برادلي على مساهماتهما في المشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
  2. Gambus, A. Termination of eukaryotic replication forks. DNA Replication. 1042, 163-187 (2017).
  3. Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
  4. Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
  5. Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
  6. Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
  7. Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
  8. Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
  9. Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
  10. Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
  11. Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
  12. Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
  13. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  14. Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
  15. Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
  16. Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
  17. Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
  18. Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
  19. Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
  20. Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
  21. Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
  22. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  23. Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
  24. Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
  25. Brayner, R. The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today. 3 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
  27. Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
  28. Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
  29. Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
  30. Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
  31. Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
  32. Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
  33. Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
  34. Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
  35. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  36. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  37. Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
  38. Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
  39. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  40. Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  41. Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).

Tags

علم الأحياء، العدد 193،
عرض توضيحي لمقايسة ألياف الحمض النووي للتحقيق في تلف الحمض النووي وديناميكيات الإصلاح التي تسببها الجسيمات النانوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar,… More

Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter