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Biology

Demonstration des DNA-Faser-Assays zur Untersuchung von DNA-Schäden und Reparaturdynamik durch Nanopartikel

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

Die Methodik hilft bei der Analyse der Variation der DNA-Replikationsdynamik in Gegenwart von Nanopartikeln. Je nach Zytotoxizität des interessierenden Materials können unterschiedliche Methoden angewendet werden. Darüber hinaus wird eine Beschreibung der Bildanalyse bereitgestellt, um bei der DNA-Faseranalyse zu helfen.

Abstract

Die Exposition gegenüber Nanomaterialien kann zu Replikationsstress und genomischer Instabilität in Zellen führen. Der Grad der Instabilität hängt von der Chemie, der Größe und Konzentration der Nanomaterialien, dem Zeitpunkt der Exposition und dem exponierten Zelltyp ab. Mehrere etablierte Methoden wurden verwendet, um aufzuklären, wie endogene/exogene Wirkstoffe die globale Replikation beeinflussen. Assays auf Replikon-Ebene, wie z. B. der DNA-Faser-Assay, sind jedoch unerlässlich, um zu verstehen, wie diese Wirkstoffe die Initiierung, den Abbruch und die Progression der Replikationsgabel beeinflussen. Wenn man dies weiß, kann man besser verstehen, wie Nanomaterialien die Wahrscheinlichkeit einer Mutationsfixierung und genomischen Instabilität erhöhen. Wir verwendeten RAW 264.7 Makrophagen als Modellzellen, um die Replikationsdynamik unter Graphenoxid-Nanopartikel-Exposition zu untersuchen. Hier demonstrieren wir das grundlegende Protokoll für den DNA-Faserassay, das die Pulsmarkierung mit Nukleotidanaloga, die Zelllyse, das Verteilen der pulsmarkierten DNA-Fasern auf Objektträger, die fluoreszierende Immunfärbung der Nukleotidanaloga innerhalb der DNA-Fasern, die Bildgebung der Replikationsintermediate innerhalb der DNA-Fasern mittels konfokaler Mikroskopie und die Replikations-Zwischenanalyse mit einer computergestützten Scoring- und Analysesoftware (CASA) umfasst.

Introduction

Während jedes Zellzyklus sorgt die DNA-Replikation für eine genaue Genomduplikation1. Die eukaryotische chromosomale Replikation hängt im Wesentlichen von drei Faktoren ab: dem Zeitpunkt des Auslösens mehrerer Replikationsurlinge, der Geschwindigkeit der Forks, die aus den gefeuerten Ursprüngen hervorgehen, und der Beendigung des Replikationsprozesses, wenn zwei Replikationsforks von benachbarten Ursprüngen aufeinandertreffen2. Für die hochgenaue Übertragung genetischer Informationen an Tochterzellen sowie für den Erhalt der genetischen Integrität ist eine genaue DNA-Replikation von entscheidender Bedeutung. Wirkstoffe, die sich aus einem normalen Stoffwechsel entwickeln oder auf künstliche oder natürliche Umweltmaterialien zurückzuführen sind, greifen das Genom ständig an. Diese endogenen und exogenen Agenzien führen dazu, dass die Replikationsgabeln aufgrund von DNA-Schäden, die durch diese Agenzien verursacht werden, verlangsamt oder gestoppt werden, und dass die Gabeln als Reaktion auf diese Schwierigkeiten vorübergehend verlangsamt oder gestoppt werden, wird als Replikationsstress3 bezeichnet. Als Reaktion auf Replikationsstress haben Zellen mehrere molekulare Signalwege entwickelt, die die Stabilität der gestörten Replikationsgabeln aufrechterhalten und es ihnen ermöglichen, neu zu starten4. In Bezug auf die genetische Stabilität, das Überleben von Zellen und menschliche Krankheiten haben sich diese Mechanismen der Replikationsstressreaktion als Schlüsselfaktoren für die Aufrechterhaltung eines gesunden Genoms, die Sicherung des Zellüberlebens und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Krankheiten herausgestellt5.

Einer der exogenen Wirkstoffe, die in der Lage sind, Replikationsstress zu erzeugen, sind Nanopartikel. Nanopartikel sind Partikel mit einer Größe von 1 nm bis 100 nm6. Aufgrund ihrer großen Oberfläche, ihrer unverwechselbaren Formen und ihrer einzigartigen chemischen Eigenschaften werden Nanopartikel in verschiedenen medizinischen, pharmazeutischen, ökologischen und industriellen Anwendungen eingesetzt 7,8. Während Nanopartikel viele potenzielle Vorteile haben, können einige von ihnen (aufgrund ihrer vererbten Natur oder Langlebigkeit) giftig werden. Nanopartikel können sich auch durch den natürlichen Verschleiß medizinischer Implantate bilden und in den periprothetischen Bereich freigesetzt werden 9,10.

Aufgrund der Exposition des Menschen gegenüber einer Vielzahl von Nanopartikeln, die für verschiedene Anwendungen hergestellt werden, hat die Forschung auf dem Gebiet der Toxizität von Nanopartikeln in den letzten 10 Jahren enorm zugenommen11. Während diese Forschungsbemühungen eine Fülle von Informationen über die potenzielle Bedrohung durch Nanopartikel für die menschliche Gesundheit zutage gefördert haben, ist das Wissen über das Potenzial von Nanopartikeln, Genotoxizität zu verursachen, immer noch begrenzt. Bisher wurde entdeckt, dass diese Nanopartikel physikalisch mit der DNA interagieren, DNA-Schäden fördern und die Proteine, die für die Reparatur oder Replikation von DNA verantwortlich sind, beschädigen oder stören können12. Um zu erkennen, wie sie die DNA-Replikation stören, werden in der Regel DNA-Faserkämmen, strahlenresistente DNA-Synthese (RDS) und DNA-Faseranalyse verwendet13,14,15,16.

Die DNA-Faserkämmmethode ist flexibel und gibt Aufschluss über die Dynamik der Replikationsgabel auf Einzelmolekülebene17. Im Wesentlichen wird ein versalzenes Deckglas vorsichtig aus der DNA-Lösung herausgezogen, sobald die DNA-Enden daran binden. Die DNA-Moleküle werden durch den Meniskus der Lösung begradigt und ausgerichtet. Die Homogenität, der Abstand und die Ausrichtung der DNA-Fasern unterstützen genaue und zuverlässige Messungen der Länge des Faserstrangs. Durch die Anpassung der Länge und Abfolge der Behandlungen und der Medikamente, die verwendet werden, um Stress oder Schäden zu verursachen, können viele Aspekte des Gabelfortschritts mit dieser Anwendung überwacht werden. Bei dieser Methode wird ein duales Labeling-System verwendet, mit dem die Geschwindigkeit und der Fortschritt der Replikationsgabel bewertet werden17,18. Auf der anderen Seite macht sich die 2D-Gelelektrophorese die Tatsache zunutze, dass sich bei der Agarose-Gelelektrophorese verzweigte DNA-Strukturen langsamer bewegen als lineare DNA-Moleküle gleicher Masse, was eine saubere Trennung der beiden in einem 2D-Lauf ermöglicht. Tatsächlich wird diese Methode untersucht, um DNA-Moleküle im ersten Durchlauf nach ihrer Masse und im zweiten orthogonalen Durchlauf nach ihrer Form zu trennen. Nach genomischer DNA-Fragmentierung entwickeln die ungewöhnlichen Replikations- und Rekombinationsintermediate eine verzweigte Form, und sie können von den häufigeren linearen Molekülen im 2D-Gel19 unterschieden werden.

Die RDS-Methode wird verwendet, um zu bestimmen, wie die globale DNA-Synthese beeinflusst wird. Bei dieser Methode wird der Grad der Hemmung der globalen Replikation bestimmt, indem die Menge der eingebauten radioaktiv markierten Nukleotide, wie z. B. [14C]Thymidin, in unbehandelten und behandelten Zellen verglichen wird14,20. Der prozentuale Unterschied in der radioaktiven Markierung zwischen den unbehandelten und den behandelten Zellen stellt das Ausmaß dar, in dem der DNA-schädigende Wirkstoff die DNA-Synthese beeinflusst. In ähnlicher Weise nutzt eine andere Methode die Fähigkeit von Zellen, Nukleotidanaloga wie BrdU (5-Brom-2′-desoxyuridin) für die Durchflusszytometrie zu integrieren, um die Gesamtraten der DNA-Synthese zu messen21,22. Diese Methoden zeigen zwar, wie DNA-schädigende Wirkstoffe die globale DNA-Synthese beeinflussen, aber nicht, wie einzelne Replikons betroffen sind. In der Tat sind Assays auf Replicon-Ebene unerlässlich, um die Entstehung und das Ausmaß der genomischen Instabilität im Falle einer Exposition gegenüber toxischen Partikeln (Nanomaterialien) besser zu verstehen. DNA-Faser-Autoradiographie und Elektronenmikroskopie sind einige Methoden, die verwendet werden, um dies zu bestimmen23,24,25,26.

Die Konzepte der Replikationsblasen und der bidirektionalen Replikation aus ungleichmäßig verteilten Quellen wurden zunächst mit Hilfe von Einzelmolekültests wie Elektronenmikroskopie und DNA-Faser-Autoradiographie entwickelt27,28. Die direkte Beobachtung von verzweigten Replikationszwischenprodukten auf bestimmten Molekülen, die über ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter verteilt sind, wird durch die Elektronenmikroskopie erheblich erleichtert. Diese Methode, die auch heute noch verwendet wird, um pathologische Verschiebungen an Replikationsgabeln zu verfolgen, wurde verwendet, um den ersten eukaryotischen Ursprung der DNA-Replikation zu lokalisieren28. Die Faserautoradiographie konzentriert sich auf das Konzept der autoradiographischen Identifizierung neu replizierter Areale und der Pulsmarkierung von Chromosomen mit tritiiertem Thymidin. Die erste quantitative Auswertung von Herkunftsdichten und Replikationsgabelraten in genomischen Sequenzen von Metazoen wurde durch DNA-Faser-Autoradiographieermöglicht 29.

Derzeit haben Faserfluorographiemethoden die Autoradiographie ersetzt, vor allem, weil die Faserfluorographie viel schneller ist als die Autoradiographie. Bei der Faserfluorographie werden zwei halogenierte Nukleotidderivate, wie Brom- (Br), Chlor- (Cl) oder Iododesoxyuridin (IdU), nacheinander in frisch replizierte DNA eingebaut und dann durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpernidentifiziert 30. Die mikroskopische Betrachtung der entstehenden DNA, die eines oder beide Analoga eingebaut hat, wird durch Immunfärbung eines der Analoga in einer Farbe und des anderen Analogons in einer anderen Farbe ermöglicht (z. B. Immunfärbung der entstehenden DNA mit eingebautem IdU-Rot und eingebautem CldU-Grün) (Abbildung 1)21. Viele verschiedene Arten von Replikationszwischenprodukten können durch DNA-Faseranalyse identifiziert werden. Die am häufigsten untersuchten sind einzelne Verlängerungsgabeln, Initiationen und Abschlüsse. Einzelne längliche Gabeln haben ein Replikationsmuster von Rot gefolgt von Grün (Rot-Grün; Abbildung 2A). 13 Die Längen dieser Zwischenprodukte werden häufig verwendet, um die Gabelgeschwindigkeit (d. h. die Gabellänge/Pulszeit) oder den exonukleolytischen Abbau von entstehender DNA durch Spurverkürzung zu messen (Abbildung 2E)30,31,32. In einer Studie von Mimitou et al. wurde festgestellt, dass bei langfristiger Exposition gegenüber Hydroxyharnstoff, einem Replikationsgift, das Doppelstrangbrüche in der DNA verursacht, RE11 rekrutiert wurde33. MRE11 ist eine Exonuklease, die für ihre 3'-5'-Exonuklease-Aktivität bekannt ist und in der Lage ist, die Enden der DNA zur Reparatur zu durchtrennen. Daher kann man, wenn man toxischen Stoffen ausgesetzt ist, einen exonukleolytischen Abbau von entstehender DNA beobachten, d. h. die Verkürzung des DNA-Strangs aufgrund der Exposition gegenüber einem DNA-schädigenden Mittel34.

Brüche der Replikationsgabel, die durch physikalische Obstruktionen (DNA-Protein-Komplexe oder DNA-Läsionen), chemische Hindernisse oder Mutationen verursacht werden, können die Replikation stoppen und eine homologe Rekombination erfordern, um sie neu zu starten. Dies wird als beeinträchtigte Gabelprogression bezeichnet. Zahlreiche In-vitro - und In-vivo-Untersuchungen haben gezeigt, dass die Transkription gelegentlich das Fortschreiten der Replikationsgabel auf diese Weise verhindern kann35.

Initiationen sind Replikationsurmen, die während des ersten oder zweiten Impulses ausgelöst werden. Ursprünge, die während des ersten Impulses ausgelöst werden und Replikationsgabeln haben, die weiterhin aktiv sind, weisen ein grün-rot-grünes Muster auf (Abbildung 2B, unten). Ursprünge, die während des zweiten Pulses initiiert werden, haben ein rein grünes Muster (Abbildung 2B, oben) und werden manchmal als neu initiierte Ursprünge bezeichnet, sodass diese Ursprünge von denen unterschieden werden können, die während des ersten Pulses initiiert werden. Der Vergleich der relativen Prozentsätze der neu gebrannten Ursprünge zwischen zwei experimentellen Bedingungen ermöglicht es zu verstehen, wie eine Zelle auf einen DNA-schädigenden Wirkstoff oder das Vorhandensein oder Fehlen eines Proteins reagiert. Terminierungen werden erstellt, wenn zwei Replikationszweige aus benachbarten Replicons zusammengeführt werden, und sie weisen ein rot-grün-rotes Muster auf (Abbildung 2D)30.

Basierend auf den oben beschriebenen Fakten wird die DNA-Faseranalyse derzeit als bevorzugte Methode angesehen, um die Variation der DNA-Replikationsdynamik zu untersuchen, die durch toxische Substanzen wie Nanomaterialien verursacht wird. Dank der Entdeckung dieser Technologie verfügen die Forscher nun über ein gutes Verständnis und Wissen über die Dynamik der genomweiten DNA-Replikation in Eukaryoten, sowohl quantitativ als auch qualitativ36. Basierend auf den Ergebnisvariablen können verschiedene Methoden angewendet werden. Einige Beispiele für Methoden zur Untersuchung der Variationen von DNA-Schäden, die durch äußere Einflüsse/Nanopartikel induziert werden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Das übergeordnete Ziel der in dieser Arbeit beschriebenen DNA-Faseranalysemethode ist es, zu bestimmen, wie Nanopartikel den Replikationsprozess in vitro beeinflussen und wie sie verschiedene Gewebe unterschiedlich beeinflussen.

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Protocol

1. Herstellung von Antikörpern und Puffer

  1. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung, Maus-Anti-BrdU in einer Verdünnung von 1:300 in 5 % BSA und Ratten-Anti-BrdU in einer Verdünnung von 1:500 in 5 % BSA vor.
  2. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung, Alexafluor 594 Kaninchen-Anti-Maus in einer Verdünnung von 1:300 in 5 % BSA und Alexafluor 488 Huhn-Anti-Ratte in einer Verdünnung von 1:500 in 5 % BSA vor.
  3. Bereiten Sie die tertiäre Antikörperlösung, Alexafluor 594 Ziegen-Anti-Kaninchen in einer Verdünnung von 1:1.000 in 5 % BSA und Alexafluor 488 Ziegen-Anti-Huhn in einer Verdünnung von 1:1.000 in 5 % BSA vor.
  4. Bereiten Sie 10 ml Lysepuffer in ddH 2 O mit2ml 1 M Tris (pH 7,4), 1 ml 0,5 M EDTA und 0,5 ml 10 % SDS vor.

2. Vorbereitung für den Fasertest

  1. Tag 1: Zellkultur und Nanomaterialbehandlung für den Faserassay
    1. Platte RAW 264,5 Makrophagenzellen oder die Zellen von Interesse, so dass sich die Zellen am Tag des Experiments in der logarithmischen Phase ihres Wachstums befinden. Fügen Sie bei RAW-Zellen für jede Bedingung 5 x 104 Zellen/Well zu 24-Well-Platten hinzu. Pflegen Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 und 98 % Luftfeuchtigkeit. Tabelle 1 beschreibt die Bestandteile der verwendeten Medien. Lassen Sie die Zellen zu 75%-80% Konfluenz wachsen17,37.
    2. Nachdem die Zellen den Grad von 75%-80%-Konfluenz erreicht haben, entfernen Sie das Medium von den Platten, nehmen Sie die Hälfte des Mediums und reservieren Sie es für den CldU-Impuls (CldU-Reserve) und fügen Sie der anderen Hälfte 5 μL IdU in einer Endkonzentration von 50 μM hinzu. Mischen Sie das IdU-haltige Medium und geben Sie es wieder in die Platten. Legen Sie die Zellen mit IdU für 20 Minuten in den Inkubator.
    3. Legen Sie das CldU-Reservemedium auf 37 °C, um es vorgewärmt zu halten. Fügen Sie diesem Medium CldU kurz vor dem CldU-Impuls hinzu.
    4. Nach 20 Minuten wird das IdU-Medium-Gemisch angesaugt und die Zellen durch leichtes Drehen der Platte vorsichtig mit 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen. Entsorgen Sie das PBS.
    5. Behandeln Sie die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Nanopartikeln in 500 μl des Mediums und inkubieren Sie weitere 30 Minuten. Verwenden Sie für diese Studie behandelte Graphenoxid-Nanopartikel mit einer Konzentration von 25 μg/ml.
    6. Aspirieren Sie die Mischung aus Behandlungsmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 500 μl PBS, indem Sie die Platte vorsichtig drehen. Entsorgen Sie das PBS. Fügen Sie 5 μl CldU (100 μM final
    7. Konzentration) in das CldU-Reservemedium und bedecken die Zellen mit dem CldU-Reservemedium. Legen Sie die Zellen für die Dauer des CldU-Impulses für 20 Minuten in den Inkubator.
    8. Waschen Sie die Zellen mit PBS, kratzen Sie sie 3-4 Minuten lang ab oder trypsinisieren Sie sie, geben Sie dann 5 ml Medium auf die Platte und sammeln Sie die Zellen.
    9. Bei 264 x g 4 Min. schleudern. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskaltem PBS. Bestimmen Sie die Zellzahlen mit einem Trypanblau-Assay (Hämozytometerzählung) und verdünnen Sie die Zellen dann auf ~200-400 Zellen/μl. Halten Sie die Zellsuspension während der Zellzählung auf Eis.
      HINWEIS: Wenn möglich, begrenzen Sie die Zeit, in der die Zellen auf dem Eis sitzen. Dies kann dazu beitragen, eine Perle aus Zelllösung entlang der Oberseite des Objektträgers zu erhalten. Wenn sie auf Eis aufbewahrt werden, lassen Sie sie weniger als 30 Minuten eingeschaltet.
  2. Tag 1: Aufbereitung der DNA-Fasern
    1. Beschriften Sie die Objektträger (Objektträger, 75 mm x 25 mm) mit Bleistift mit dem Versuchszustand und dem Datum.
    2. Nehmen Sie 2 μl Zellen in eine Pipette, halten Sie die Pipette in einem Winkel von ~45°, platzieren Sie die Pipette etwa 1 cm unter dem Objektträgeretikett und bewegen Sie die Pipette horizontal auf das Objektträgeretikett. Während sich die Pipette über den Objektträger bewegt, geben Sie jeweils ein wenig von der Zelllösung ab. Erstellen Sie mehrere Zeilen von Zellen auf jeder Folie (kritischer Schritt).
      Anmerkungen: Es sollte eine horizontale Linie der Zellaufhängung über dem Objektträger verlaufen. Wenn die Zellsuspension abperlt, geben Sie 5-10 μl Zellmedium in den Behälter mit der Zellsuspension, da dies dazu beitragen kann, dass die Lösung beim erneuten Auftragen auf dem Objektträger haftet.
    3. Lassen Sie die Lösung mit den Zellen verdampfen, bis die Lösung klebrig und klebrig aussieht. Zu diesem Zeitpunkt ist etwas Flüssigkeit mit den Zellen verbunden, aber nicht viel. Dieser Schritt dauert zwischen 8 und 20 Minuten und variiert je nachdem, wie viel Luftfeuchtigkeit in der Luft ist.
      Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die gesamte Lösung nicht verdunstet ist, da es dadurch sehr schwierig ist, gerade und ausgerichtete DNA-Fasern zu erhalten, da die meisten, wenn nicht sogar die gesamte DNA zusammenkleben und sich nicht trennen können.
    4. Wenn die Lösung klebrig ist, überlagern Sie die Zellen mit 15 μl Spreizpuffer (Lysepuffer) pro Zellzeile und achten Sie darauf, dass die Pipettenspitze den Objektträger nicht berührt. Warten Sie 10 Minuten. Kippen Sie den Objektträger in einem Winkel von 25° und legen Sie das Etikett des Objektträgers horizontal gegen die Kante eines Röhrchengestells (der untere Teil des Etiketts sollte mit dem Rand des Röhrchengestells übereinstimmen).
    5. Lassen Sie die DNA-Aufstriche mindestens 4 Stunden ab dem Zeitpunkt, an dem die letzten Objektträger gemacht wurden, an der Luft trocknen.
      Anmerkungen: Ein Zeitraum von 4 h bis 12 h ist gut zum Trocknen. Lassen Sie sie jedoch nicht über Nacht trocknen. Wenn man sie über Nacht trocknen lässt, gibt es viel entspannte DNA, aber nur sehr wenige gerade und ausgerichtete DNA-Fasern.
  3. Tag 1: Fixierung der DNA-Fasern und Einfrieren
    1. Sobald die Objektträger getrocknet sind, fixieren Sie die Objektträger mit Methanol:Essigsäure (3:1), indem Sie die Objektträger 2 Minuten lang eintauchen. Führen Sie diesen Schritt unter einer Haube durch und lassen Sie die Rutschen über Nacht an einem Ort mit begrenzter Lichteinwirkung trocknen oder decken Sie die Rutschen mit einem Alufolienzelt ab.
  4. Tag 2
    1. Legen Sie die Objektträger in einen Objektträger. Legen Sie die Objektträger für mindestens 24 Stunden bei −20 °C ab. Dieser Schritt verbessert die Auflösung oder Schärfe des Bildes.

3. Durchführung des DNA-Faser-Assays

  1. Denaturierung der DNA
    1. Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer mit kleinen Pipettenspitzenboxen mit Deckel vor. Füllen Sie die Behälter zur Hälfte mit Wasser und stellen Sie sie für mindestens 1 h in ein 37 °C warmes Wasserbad.
    2. Nehmen Sie die Objektträger bei −20 °C heraus und tauen Sie sie einige Sekunden lang auf. Legen Sie die Objektträger vorsichtig in ein Coplin-Glas mit deionisiertem Wasser (DI), damit die beschichteten Oberflächen die Wände des Glases nicht berühren. Inkubieren Sie den Objektträger 20 Sekunden lang und gießen Sie dann vorsichtig das Wasser aus.
    3. Geben Sie 2,5 M HCL so in das Coplin-Glas, dass es alle Objektträger bedeckt. Warten Sie 80 Minuten. Dies ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Eine Änderung der Zeit kann das Ergebnis des Bildes verändern.
    4. Waschen Sie die Objektträger 1x mit PBS plus Tween (PBS + 0,1% Tween [Endkonzentration]) und anschließend 2x mit PBS für jeweils 3 min bei Raumtemperatur (RT).
  2. Immunfärbung
    1. Bewahren Sie die Objektträger für die folgenden Schritte in der befeuchteten Kammer auf. Blockieren Sie die Objektträger mit 5 % BSA in PBS für 30 Minuten bei RT und decken Sie sie mit Deckgläsern, Deckgläsern aus einem Western-Blot-Beutel oder transparenten Plastikfolien ab.
    2. Entfernen Sie nach dem Blockieren vorsichtig das Deckglas, entfernen Sie die Blockierlösung und tupfen Sie den Objektträger auf ein Papiertuch (klopfen Sie auf den Objektträger auf dem Handtuch), um die überschüssige Blockierlösung zu entfernen.
    3. Fügen Sie 100 μl der primären Antikörperlösung über die Länge des Objektträgers hinzu. Fügen Sie ein neues Plastikdeckglas hinzu und warten Sie 2 Stunden. Achten Sie beim Anbringen des Deckglases darauf, dass sich keine Blasen bilden.
    4. Nach 2 Stunden die Antikörperlösung abklopfen und die Objektträger in einem mit PBS gefüllten Coplin-Glas 2x bei RT ausspülen. Verwenden Sie jedes Mal frisches PBS, um die Objektträger zu waschen.
    5. Blockieren Sie die Objektträger erneut, indem Sie 200 μl (drei bis vier Tropfen) 5 % BSA entlang jedes Objektträgers hinzufügen und ein Plastikdeckglas hinzufügen. Warten Sie 15 Minuten.
    6. Nehmen Sie das Deckglas ab, klopfen Sie das überschüssige BSA auf einem Papiertuch ab und fügen Sie 100 μl der sekundären Antikörperlösung über die Länge des Objektträgers hinzu. Fügen Sie ein neues Plastikdeckglas hinzu und warten Sie 1 Stunde.
    7. Nehmen Sie das Deckglas ab, klopfen Sie das überschüssige BSA auf einem Papiertuch ab und waschen Sie die Dias 2x in PBS bei RT.
    8. Blockieren Sie die Objektträger erneut, indem Sie 200 μl (drei bis vier Tropfen) 5 % BSA entlang jedes Objektträgers hinzufügen und ein Plastikdeckglas hinzufügen. Warten Sie 15 Minuten.
    9. Entfernen Sie bei Bedarf das Deckglas, entfernen Sie die überschüssige BSA auf einem Papiertuch und fügen Sie 100 μl tertiäre Antikörperlösung über die Länge des Objektträgers hinzu. Fügen Sie neue Plastikdeckgläser hinzu und warten Sie 30 Minuten.
    10. Waschen Sie die Objektträger mit PBS 3x. Entfernen Sie das überschüssige PBS und lassen Sie es vollständig trocknen.
    11. Nach dem Trocknen das Eindeckmedium einlegen und Glasdeckgläser (24 mm x 60 mm) vorsichtig über das Einbettmedium legen, damit Blasen vermieden werden. Beschriften Sie die Folien neu und lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln liegen.

4. Bildaufnahme

  1. Visualisieren Sie die immungefärbten DNA-Fasern mit einem Immunfluoreszenzmikroskop, das mit einer Kamera, einem 60x-Objektiv und geeigneten Filtersätzen ausgestattet ist, um die Farbstoffe Alexafluor 488 und 594 nachzuweisen.
  2. Nehmen Sie Bilder für die Analyse in Regionen auf, in denen die Fasern gut getrennt und nicht verschränkt sind. Es ist wichtig, Bilder in verschiedenen Bereichen entlang des Objektträgers aufzunehmen, da das Aufnehmen von Bildern in nur einem Teil des Objektträgers möglicherweise keine repräsentativen Daten zu allen auf dem Objektträger gefundenen Replikationszwischenstufen liefert.
  3. Wenn möglich, erhalten Sie Faserbilder von 20 verschiedenen Regionen auf einem Objektträger. Verwenden Sie nur einen Kanal, um die Bereiche für die Aufnahme von Bildern auszuwählen, um Verzerrungen zu vermeiden.

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Representative Results

Nachdem genügend Bilder (von 20-100 Bildern pro Bedingung) erhalten wurden, müssen die Replikationszwischenprodukte identifiziert, gemessen und gezählt werden. Unabhängig davon, ob die Fasern manuell oder automatisch über ein Programm38 analysiert werden, muss klar definiert werden, welche Eigenschaften eine Faser aufweisen muss, damit sie gezählt oder bewertet (oder nicht gezählt oder gemessen) werden kann39. Zum Beispiel können die folgenden Fragen in Betracht gezogen werden. (1) Sollte man nur Fasern mit 100 % Immunfluoreszenz in der gesamten Faser messen und zählen, oder können sie einige Regionen ohne Immunfluoreszenz enthalten (z. B. sollten alle Zwischenprodukte in Abbildung 4Ai,ii,iii analysiert werden oder nur eine Teilmenge von ihnen?)? Was ist bei der Analyse von Fasern mit Signalverlust der maximale Signalverlust, der innerhalb einer Faser akzeptabel ist, und wie hoch ist die maximale Anzahl kontinuierlicher Pixel in der Faser, die frei von Signalen sein können (z. B. würde die Abbildung 3Aiv als Rot-Grün- oder Nur-Rot-Zwischenprodukt betrachtet werden?)? (2) Wie hoch sollten die minimalen und maximalen Faserbreiten/-längen sein? (3) Wie hoch sollte das Signal-Rausch-Verhältnis (S:N) sein, wenn entschieden wird, ob eine Faser gemessen werden soll oder nicht (z. B. wie viele Fasern sollten in Abbildung 4B für die Analyse ausgewählt werden?)? (4) Wie nah am Bildrand muss eine Faser sein, damit sie nicht gezählt oder gemessen wird? (5) Wenn ein Fluoreszenzsignal gelb ist, zählt man es dann als rot oder grün (sollte z. B. der gelbe Teil des Replikationszwischenprodukts in Abbildung 4C als rot oder grün gezählt werden?)? (6) Wie lang muss ein Farbsegment sein, um als echtes Signal gezählt zu werden (z.B. ist das Replikations-Zwischenzeichen in Abbildung 4D eine reine Grünspur, eine Grün-Rot-Grün-Spur oder eine Grün-Rot-Spur?)? (7) Wenn Sie ein automatisiertes Faseranalyseprogramm verwenden, wie sicher ist das Programm in Bezug auf die Messung/Zählung, die es gerade durchgeführt hat? (8) Wenn die Fasern manuell analysiert werden, wie konsistent sollte die Analyse über die Zeit und zwischen den Individuen sein?

In der Regel werden für die DNA-Faseranalyse die folgenden Parameter verwendet:
Signal-Rausch-Verhältnis: 3 (die Faserintensität ist dreimal größer als die Hintergrundintensität)
Faserdicke: ≤8 Pixel breit
Minimale Größe: nur rot oder grün und 10 Pixel; Rot-Grün-Spuren mit jedem Segment ≥10 Pixel; Rot-Grün-Rot- oder Grün-Rot-Grün-Spuren mit jedem Segment ≥10 Pixel.
Kontinuität des Fluoreszenzsignals: mindestens 80 % und keine Lücken im Signal größer als 6 Pixel.
Konfidenz bei der Bewertung: Konfidenzwerte sollten in einem Bild und zwischen Bildern ähnlich sein.

Neben den oben genannten Parametern ist ein weiteres wichtiges Kriterium die Auswahl einer klaren Faser, die sich bei der Bildgebung und Analyse nicht mit anderen Fasern überlappt.

Abbildung 5A zeigt repräsentative Bilder der Kontroll- (Abbildung 5Ai) und der mit Graphenoxid-Nanopartikeln behandelten Makrophagen-DNA (Abbildung 5Aii,iii). Das Bild zeigt eine Zunahme der schreibgeschützten Spuren (Terminierungen) und eine Abnahme der neu gebrannten Ursprünge in den mit Graphenoxid behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 5C). Es ist auch wichtig, die Anzahl der Bilder und die Position des Objektträgers zu berücksichtigen, von dem aus die Bilder aufgenommen wurden. Wie in Abbildung 5Aiii,C dargestellt, wurde eine Variation im Muster der Replikationszwischenprodukte (eine Zunahme der Neuursprünge im Vergleich zur Kontrolle) in einer anderen Region desselben Zustands beobachtet. Auch wenn einige dieser Beobachtungen möglicherweise keinen Einfluss auf das Gesamtergebnis haben, muss darauf geachtet werden, den Objektträger abzubilden, indem alle repräsentativen Bereiche einbezogen werden. Ideal wäre es, die Gesamtfläche der Folie in fünf bis sechs Bereiche zu unterteilen und mehrere Bilder von jeder Region aufzunehmen (Beispiel: 10 Bilder), um schlüssige Faserdaten für jede Folie zu finden. Es ist ideal, etwa 500 Zwischenprodukte (Abbildung 5B) aus mehreren Objektträgern/Bedingungen auszuwählen. Bei diesen Variationen in der Replikation kann die Zwischenquantifizierung aus der DNA-Faseranalyse verwendet werden, um die Variation der DNA-Replikationsdynamik zu untersuchen, die durch Graphenoxid-Nanopartikel oder die Genotoxizität anderer Nanomaterialien verursacht wird. Daher kann durch diese neue Methodik im Vergleich zu anderen in der Einleitung erwähnten Analysen sowohl ein qualitatives als auch ein quantitatives Verständnis der Dynamik der genomweiten DNA-Replikation erlangt werden.

Figure 1
Abbildung 1: DNA-Faser-Assay. Schematische Darstellung des Assays mit einem Überblick über die wichtigsten Schritte der DNA-Faseranalyse. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Immunfärbung der DNA-Replikations-Zwischenprodukte. Schematische Darstellung verschiedener Replikationszwischenprodukte, die durch sequentielle Pulsmarkierung mit IdU (rot) und CldU (grün) identifiziert wurden. Skala: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Exposition gegenüber Nanopartikeln. Verschiedene Methoden zur Untersuchung von Variationen in Nanopartikel-induzierten DNA-Schäden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Eigenschaften der zu bewertenden DNA-Fasern. Beispiele für Replikationszwischenprodukte in einem Image. (A) Lücken in der Immunfluoreszenz; (i) 0 % Immunfluoreszenzsignalverlust über das Replikationszwischenprodukt; (ii) ~7% Signalverlust; (iii) 50% Signalverlust; und (iv) >90 % Signalverlust. (B) Ein Bereich mit vielen überlappenden Replikationszwischenstufen (der Pfeil zeigt den Bereich mit deutlicher Faserüberlappung an). (C) Eine DNA-Faser mit einer gelben Region. (D) Ein Replikationszwischenprodukt, das für Interpretationen offen ist (der Pfeil zeigt die Lücken in der Faser an). Skala: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Analyse und Interpretation von DNA-Fasern. (A) Repräsentative DNA-Faserbilder von (i) Kontrollmakrophagenzellen und (ii,iii) Makrophagenzellen, die 20 Minuten lang mit Nanopartikeln behandelt wurden, bei einer Konzentration von 25 μg/ml. Die Bilder ii und iii wurden aus verschiedenen Bereichen des Objektträgers aufgenommen. (B) Repräsentative automatisierte Softwareanalyse der Kontroll- und Nanopartikel-behandelten Bedingungen. Für diese Analyse haben wir das von Wang et al. entwickelte automatisierte DNA-Faser-Tracking- und Messprogramm verwendet.38. Die Zahlen in der Abbildung zeigen die Anzahl der analysierten DNA-Spuren. (C) Grafische Darstellung der Softwareanalyse der Kontroll- und Nanopartikel-behandelten Bedingungen. NP steht für Nanopartikel. Der relative Prozentsatz der Zwischenpopulation (z. B. nur für Rot) wird aus der Gesamtzahl der analysierten Zwischenprodukte berechnet. Vergleicht man NP-behandeltes Bild 1 mit Bild 2, so gibt es große Unterschiede zwischen den beiden Bildern. Daher ist es wichtig, viele Bilder auf der Folie zu erhalten, um zu verstehen, wie sich eine experimentelle Bedingung auf den Replikationsprozess auswirkt. Abkürzungen: R = rot; G = grün. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Medienkomposition
10% fötales Kälberserum
1%ige Penicillin-Streptomycin-Lösung (10000 Einheiten/ml)
1% L Glutamin (200 mM)
Dulbecco's Modified Eagle's Mittelhohe Glukose

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums für die Makrophagen-Zellkultur.

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Discussion

Wir diskutieren hier eine Methode, die bei der Analyse der Variation der DNA-Replikationsdynamik in Gegenwart von Nanopartikeln durch den DNA-Faser-Assay hilft. Die wichtigsten kritischen Schritte des Standardtests sind im Protokoll beschrieben (Schritt 2.2.2 und Schritt 3.1.3). Es wird immer empfohlen, einen Bereich mit begrenzter Lichteinwirkung von oben und konstantem Luftstrom zu verwenden, um lichtinduzierte DNA-Brüche in den Objektträgern zu vermeiden und die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Besonderes Augenmerk muss auf die Zeitdauer für die Trocknung des Zelllysats auf den Objektträgern gelegt werden. Eine Übertrocknung wirkt sich negativ auf die Faserverteilung aus. Der zweite kritische Schritt ist die Faserdenaturierung mit einer sauren Lösung. Die Dauer der Säurewäsche sollte für alle Objektträger desselben Experiments gleich gehalten werden. Die Fehlersuche für diese beiden Schritte zur Suche nach optimalen Bedingungen (Lysezeit, Lysatvolumen auf dem Objektträger, Trocknungszeit und Säurewaschzeit) wird für verschiedene Zelltypen und Laborumgebungen empfohlen.

Wie in Abbildung 3 erläutert, kann die Expositionsdauer von Nanopartikeln variiert werden, um die durch die Nanopartikel induzierte Veränderung der DNA-Replikationsdynamik quantitativ zu bestimmen. Um die anfänglichen Auswirkungen der Replikationsdynamik zu bestimmen, wäre eine Kurzzeitexposition wie 1 min, 20 min oder 30 min mit unterschiedlichen Dosierungen angemessen. Der Unterschied in den Replikationsmustern (wie in Abbildung 2 dargestellt) nach langfristiger Exposition der Zellen gegenüber den Nanomaterialien kann durch den Vergleich der Muster der IdU- und CIdU-Exposition (jeweils 20 min) vor und nach der Nanopartikelbehandlung bestimmt werden. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um das Abwürgen der Gabel, die Verlangsamung der Gabel und die unterschiedliche Entstehungszündung zu verschiedenen Expositionszeiten zu bestimmen, die als Auswirkungen einer akuten und chronischen Exposition gegenüber Nanomaterialien interpretiert werden können39,40.

Es gibt mehrere vielversprechende Techniken, um die Variation in der DNA-Replikation nachzuweisen, wie z. B. DNA-Kämmen und die RDS-Methode. Im Vergleich zu diesen Verfahren ist der DNA-Faser-Assay jedoch bequem und kostengünstig, ohne dass teure Analyseinstrumente erforderlich sind41. Die Grenzen dieser Methode sind die experimentelle Dauer, die Zeit, die benötigt wird, um genügend Bilder für die Quantifizierung aufzunehmen, sowie die Softwareanalyse. Dieser Ansatz wird jedoch sicherlich die nanotoxikologische Forschung bei der Bestimmung der genomischen Instabilität unterstützen, die durch Partikel in Zelllinien sowie in verschiedenen Gewebeproben und zwischen verschiedenen Spezies verursacht wird.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Blazer Foundation, das Medical Biotechnology Program at Biomedical Sciences, UIC Rockford, und das Department of Health Science Education, UIC Rockford. Die Autoren danken Ananya Sangineni und James Bradley für ihre Beiträge zum Projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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References

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Biologie Heft 193
Demonstration des DNA-Faser-Assays zur Untersuchung von DNA-Schäden und Reparaturdynamik durch Nanopartikel
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Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

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